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INTRODUCCIÓN
Los bambúes que pertenecen a la subfamilia Bambusoideae exhiben gran diversidad genética distribuida alrededor del mundo, excepto en la Antártida y Europa (Clark et al. 2015). El bambú representa a las especies leñosas con mayor impacto económico, social, ecológico y ambiental a nivel global (Clark et al. 2015, Thapa et al. 2018). En el Perú se desarrollan distintas especies de bambú, tanto nativas como introducidas (Olivier 2008), siendo Guadua angustifolia Kunth. la especie introducida con mayor realce económico para la sostenibilidad del nororiente peruano (Landauro et al. 2016, Móstiga et al. 2019). Sin embargo, la expansión y cultivo comercial del bambú se ha limitado por el precario sistema de propagación (rizomas y culmos), así como por el prolongado tiempo que la semilla botánica requiere para su desarrollo (Casanova et al. 2019).
Para superar las limitantes de la propagación y producción masiva de plantas élite, es ineludible el aporte del cultivo de tejidos vegetales, debido a que permite obtener plantas mediante la regeneración in vitro. La propagación vía organogénesis asegura estándares de sanidad y calidad, permitiendo, además, la producción masiva de plántulas en corto tiempo. Sin embargo, el cultivo in vitro de bambúes es un proceso poco explorado (Ribeiro et al. 2016), por lo tanto, se tiene diversos factores que influyen en los resultados. La consistencia del medio de cultivo se ha estudiado para el establecimiento in vitro de diversas especies de bambú puesto que es un factor que puede influir en la asimilación de nutrientes, la oxidación y contaminación del explante (García-Ramírez et al. 2010, Santos et al. 2019).
Por otro lado, la micropropagación del bambú G. angustifolia Kunth está condicionada por la prevalencia de hongos y bacterias endófitos que originan la contaminación superficial del explante (Nadha et al. 2012, Ray y Ali 2016, Sandhu et al. 2017, Furlan et al. 2018). Esta problemática ha derivado en el desarrollo de diversos protocolos de esterilización superficial con desinfectantes, antibióticos y fungicidas comunes que no son totalmente eficientes (Ray y Ali 2016). Al mismo tiempo, diversos investigadores (Bakshi et al. 2015, Saini et al. 2016, Nogueira et al. 2019) informan que las soluciones a base de cloruro de mercurio (HgCl2) son eficientes en los protocolos de esterilización. Sin embargo, el uso descontrolado e inadecuada manipulación de este producto pueden traer graves consecuencias debido a su alta toxicidad (Branco et al. 2017), además de elevar los riesgos de contaminación ambiental producto de los residuos químicos generados en el cultivo in vitro (Ornellas et al. 2019).
La dificultad para obtener un desarrollo organogénico a partir de segmentos nodales con yemas axilares latentes es aún un reto mayor (Furlan et al. 2018). La importancia de controlar el desarrollo de agentes contaminantes en el medio de cultivo abre una alternativa, hacia la evaluación de productos biocidas de amplio espectro (Santos et al. 2019), los cuales podrían permitir el establecimiento aséptico de segmentos nodales. Asimismo, es necesario profundizar los estudios relacionados con la influencia de las variaciones en el medio de cultivo sobre el desarrollo de explantes del género Guadua. En ese contexto, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto conjunto de dos biocidas en el control de microorganismos epifitos o endófitos durante el establecimiento in vitro de Guadua angustifolia. Para ello, los explantes fueron pretratados con diferentes concentraciones de Germon 80 (amonio cuaternario) durante dos tiempos de inmersión, y luego se cultivaron en un medio de consistencia líquida o semisólida, suplementado con diferentes dosis de Plant Preservative MixtureTM.
MÉTODOS
Material vegetal
Material vegetal. Se recolectaron chusquines de Guadua angustifolia, procedente de un lote de guaduales ubicado en áreas reforestadas de la provincia de Bongará (Latitud 5° 54’ 27” sur y Longitud 77° 58’ 17’’ oeste), noreste del Perú. El material vegetal colectado tenía buen desarrollo morfológico y fisiológico y ausencia de patógenos, y fue trasladado a la Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza, donde se sembró en bolsas de polietileno que contenían 10 kg de una mezcla de tierra agrícola y arena (1:1), previamente se aplicó ácido indol butírico a concentración de 2.000 mg L-1. Las plantas se mantuvieron durante 6 meses en un microtúnel, a una temperatura de 24 ± 2 °C y Humedad relativa de 80 ± 2 % (Datalogger Elitech Rc-4hc). Durante este periodo, se realizó el control de la carga patogénica con aplicaciones de Carbendazim (1 mL L-1), y se estimuló la actividad fisiológica con Enziprom (2 mL L-1).
Establecimiento in vitro de segmentos nodales
Se recolectaron ramas primarias y se extrajeron segmentos nodales (1,5 cm a ambos polos del nudo) de la parte media y basal para ser usados como explantes. Cada explante contenía una yema cubierta por la hoja caulinar (verde - amarilla). En el laboratorio se retiró la hoja caulinar y dejó reposar por 15 min en agua corriente, luego se limpiaron con solución de detergente comercial (24 g L-1), seguido se sumergieron en benomil (1 g L-l) durante 25 min. Se realizaron tres enjuagues con agua destilada estéril.
En condiciones asépticas, los explantes se sumergieron en alcohol isopropílico al 70 % por 1 min, seguido de hipoclorito de sodio al 1 % más 1 gota (por cada 50 mL de solución) de Tween-20 durante 10 min. A continuación, y como etapa previa a su introducción in vitro, los explantes se sometieron a un pretratamiento por inmersión en distintas dosis (1, 1,5 y 2 mL L-1) del biocida Germon 80 y se mantuvieron en agitación constante durante dos tiempos de inmersión (10 y 20 min).
Durante la esterilización superficial se eliminó los extremos de los explantes y luego se sembraron en medio de cultivo MS (Murashige y Skook 1962) suplementado con 20 g L-1 de sacarosa, 50 mg L-1 de ácido ascórbico, 0,5 mg L-1 ácido nicotínico, 100 mg L-1 myo-inositol, 50 mg L-1 sulfato de gentamicina (Pasqualini et al. 2019a, Nogueira et al. 2019); adicionalmente contenían distintas concentraciones del biocida Plant Preservative Mixture (1, 2 y 4 mL L-1 PPMTM). El pH fue ajustado (NaOH y / o HCl) a 5,7 y, para el medio de cultivo semisólido se agregó 6 g L-1 de agar, luego se esterilizó en autoclave a 120 °C (~1 kgf cm-2) por 20 min. Los explantes se subcultivaron a intervalos de 7 días y se incubaron en una sala de crecimiento a temperatura de 25 ± 2 °C, con fotoperiodo de 16 h de luz y una intensidad luminosa de 3.000 lux proporcionado por barras fluorescentes blancas.
El experimento se condujo bajo un diseño completamente al azar con 36 tratamientos y 10 repeticiones cada una (1 explante por unidad experimental). Los tratamientos se obtuvieron de la combinación factorial de tres concentraciones de Germon 80 (amonio cuaternario), dos tiempos de inmersión (10 y 20 minutos), tres dosis de PPMTM y dos consistencias del medio de cultivo (líquido o semisólido). Después de 30 días de cultivo se evaluó el porcentaje de oxidación (supervivencia a la desinfección), porcentaje de contaminación (bacterias / hongos), porcentaje de viabilidad (explantes vivos no contaminados), número de brotes por explante y longitud del brote. Los datos en porcentaje se transformaron con Aseno x 100 y las demás variables con LN (x + 1). El análisis estadístico se realizó con la librería agricolae del Software R (R CoreTeam 2020). Las medias se compararon con la prueba de Duncan (P ≤ 0,05).
RESULTADOS
Sobrevivencia de explantes
Todos los segmentos nodales iniciaron el desarrollo de brotes durante los primeros siete días de cultivo. Sin embargo, durante este periodo, los explantes liberaron fenoles que ocasionaron el pardeamiento y oscurecimiento del medio de cultivo (figura 1A), independientemente de su consistencia. Este suceso afectó la viabilidad de los brotes y ocasionó la muerte progresiva de estos. Para contrarrestar este efecto negativo fue necesario realizar subcultivos a intervalos de siete días (figura 1B).
Figura 1 . Fenolización del medio sin subcultivo (A) y con subcultivo de explantes (B). Phenolization of the medium without subculture (A) and with subculture of explants (B).
Los resultados mostraron que el nivel más alto de oxidación (100 %) se registró en los explantes que se desinfectaron con 2 mL L-1 de Germon 80 durante 20 min y luego se cultivaron en medio (tanto al medio líquido como semisólido) suplementado con 4 mL L-1 de PPMTM. En cuanto a la contaminación, los resultados mostraron que, entre los 36 tratamientos evaluados, 21 inhibieron exitosamente el desarrollo microorganismos contaminantes, pero provocaron que el nivel de oxidación se registrara entre 40 % y 100 % (cuadro 1).
El tratamiento de los explantes con 1,5 mL L-1 de Germon 80 durante 10 min, seguido de su introducción en un medio líquido suplementado con 4 mL L-1 de PPMTM mostró una alta eficiencia para lograr la mayor tasa de viabilidad (80 %). El efecto de las diferentes concentraciones y tiempo inmersión en los biocidas, y la consistencia del medio de cultivo durante el establecimiento de segmentos nodales, se detallan en el cuadro 1.
Número y longitud de brote
Los explantes introducidos (figura 2C) desarrollaron exitosamente nuevos brotes sin la necesidad de agregar reguladores de crecimiento al medio de cultivo (figura 2D). El número promedio de brotes formados en explantes cultivados en medio líquido suplementado con 2 mL L-1 de PPMTM varió de 2,1 a 2,5 brotes, y no hubo diferencia estadística entre estos tratamientos (cuadro 1).
El crecimiento de los nuevos brotes mostró una mejor respuesta en explantes cultivados en medio líquido, y su longitud fue mayor a 5 cm, y significativamente (P ≤ 0,05) superior que la respuesta observada en explantes cultivados en medio semisólido (cuadro 1).
Figura 2 . Propagación in vitro de Guadua angustifolia. Planta donadora de explantes (A), segmento del tercio medio con presencia de la hoja caulinar (B), yemas axilares en el entrenudo (C), y proliferación de brote asépticos en medio líquido (D). Organogenesis of Guadua angustifolia. Plant donor of explants (A), segment of the middle third with presence of the caulinar leaf (B), axillary buds in the internode (C), and aseptic shoot proliferation in liquid medium (D).
Cuadro 1 Influencia de dos biocidas y la consistencia del medio de cultivo en la sobrevivencia de explantes y el desarrollo de brotes durante el establecimiento in vitro de Guadua angustifolia. Influence of biocides and the consistency of the culture medium on the survival of explants during the in vitro establishment of Guadua angustifolia.
Las medias dentro de una columna seguidas de la misma letra no son significativamente diferentes según la prueba Duncan a P ≤ 0,05.
DISCUSIÓN
El uso de biocidas en la micropropagación de bambú para reducir la contaminación microbiana es relativamente nuevo; aunque existe evidencia reciente de que se utiliza como complemento en el medio de cultivo (Santos et al. 2019), aún existen pocos estudios sobre su efecto en el pretratamiento por inmersión de los segmentos nodales (Torres et al. 2016).
En este estudio, los explantes que se trataron con 1,5 mL L-1 de Germon 80 durante 10 min y luego se cultivaron en un medio suplementado con una concentración de PPMTM de menos de 4 mL L-1, presentaron una tasa de viabilidad (explantes vivos no contaminados) entre 40 % y 80 %. Este resultado es mejor que la esterilización de explantes de Gadua chacoensis (Rojas) Londoño y P.M. Peterson utilizando una solución de NaClO al 4 % (sin adición de ningún biocida), ya que solo el 22 % de los explantes se desarrolló sin contaminación (Ornellas et al. 2019). Según Casanova et al. (2019), el mejor tratamiento para reducir la contaminación de explantes de Guadua weberbaueri Pilg. fue el uso de NaClO al 2,5 % por 10 min seguido de una segunda desinfección con NaClO al 1,5 % por 3 minutos, lo que llevó a un porcentaje de contaminación del 33 % y una tasa de sobrevivencia del 50 %. Por otro lado, Correa et al. (2014) reportaron que el tratamiento con NaClO al 2 % llevó a un 32 % de asepsia en explantes de G. angustifolia. Los resultados tan variables, indican que, es fundamental probar y perfeccionar las condiciones de cultivo in vitro para cada especie / genero de bambú (Jiménez y Guevara 2007).
Diversos estudios han descrito a la esterilización de segmentos nodales de bambú como una labor compleja, porque la esterilización superficial por sí sola no logra controlar la contaminación del explante. Por lo tanto, y con base en los resultados alcanzados, se puede mencionar que el uso de Germon 80 es una alternativa atractiva al uso de antibióticos y fungicidas convencionales para el control de contaminantes epífitos en explantes de G. angustifolia, por tratarse de un desinfectante a base de dos amonios cuaternarios, que actúan de forma sinérgica provocando la lisis celular que le confiere amplio espectro de acción.
Este estudio muestra que el medio suplementado con 4 mL L-1 de PPMTM logró un control efectivo de la contaminación microbiana. Según resultados similares de Pasqualini et al. (2019a), la adición de PPMTM (4 mL L-1) permitió reducir el desarrollo de microorganismos en el establecimiento in vitro de Bambusa oldhamii Munro, registrando una tasa de contaminación microbiana total de 4 % en medio líquido y 13 % medio semisólido. Además, para Santos et al. (2019), la adición de PPMTM (2 mL L-1 o 4 mL L-1) demostró ser eficaz para el establecimiento in vitro de Berberis vulgaris L., Phyllostachys bambusoides f. shouzhu Yi y Dendrocalamus asper B. se considera un microbiocida eficaz contra bacterias y hongos, y está compuesto de dos isotiazolonas, 5-cloro-2-metil- 3(2H)-isotiazolona y 2 metil-3(2H)-isotiazolona (Guri y Patel 1998), que pueden penetrar la pared celular microbiana e inhiben diversas enzimas clave del ciclo de Krebs y de la cadena de transporte de electrones (Plant Cell Technologies 2017). Cabe mencionar que, en este estudio, si bien la adición de 4 mL L-1 de PPMTM redujo la contaminación, este provocó mayores signos de oxidación; lo que podría estar relacionado con un posible efecto de fitotóxico por ser un compuesto ácido y, por lo tanto, es necesario evaluar el efecto de diferentes concentraciones (Thomas et al. 2017).
De acuerdo con lo planteado por Santos et al. (2019), el efecto del biocida varía según su concentración y la especie de bambú; esto último debido a las características fisiológicas y genéticas específicas de los explantes (según el genotipo) que influyen directamente durante el desarrollo in vitro (Polesi et al. 2019). Además, la dificultad para desinfectar los tejidos del bambú pude explicarse por el tipo de explante, ya que los segmentos nodales contienen alta carga de microorganismos endófitos (Pasqualini et al. 2019b), los cuales se introducen en los espacios intercelulares generados durante el aislamiento del explante (Ray y Ali 2016). Este aspecto dificulta la desinfección de los explantes debido a que los microorganismos endófitos tienen mayor profundidad de penetración en el tejido (Pasqualini et al. 2019b). En ese contexto, los biocidas como PPMTM se han descrito como una alternativa para controlar el crecimiento de hongos y bacterias endófitas (Plant Cell Technologies 2017).
Por otro lado, los explantes establecidos en medio líquido mostraron mayor formación y crecimiento de brotes comparado con el desarrollo registrado en el medio semisólido. Experiencia con similar éxito se reportó en la multiplicación in vitro de G. angustifolia utilizando un sistema de inmersión temporal (Gutiérrez et al. 2016). Estos resultados pueden visualizarse dado que el uso de medios de cultivo libre de agente gelificante facilita la movilidad de nutrientes a través del explantes, mientras que su solidificación actúa como barrera física para la liberación y absorción de los mismos (García-Ramírez et al. 2010, Ribeiro et al. 2016). A partir de estos datos se confirman que, la proliferación de brotes en bambú esta mediado por la consistencia del medio de cultivo. Cabe resaltar que, los explantes de G. angustifolia no registraron problemas visibles de hiperhidricidad; trastorno fisiológico que fue reportado en explantes de Dendrocalamus (Sandhu et al. 2017). En general, se puede mencionar que el establecimiento in vitro de G. angustifolia utilizando medio líquido tiene efectos positivos sobre la inducción y crecimiento de brotes; variables que tienen relación directa con el coeficiente de multiplicación, dado que es posible obtener mayor número de plantas para ser transferidos a las fases de enraizamiento y aclimatación (García-Ramírez et al. 2010).
CONCLUSIONES
Este estudio muestra que el efecto conjunto del biocida Germon 80 (utilizado para el pretratamiento de explantes por inmersión) y PPMTM (agregado al medio de cultivo) presenta diferentes respuestas dependiendo de la concentración del biocida. Se ha observado que la adición de 2 mL L -1 o 4 mL L -1 de PPM™ redujo el desarrollo de microorganismos contaminantes, sin embargo, a estas concentraciones, la tasa de viabilidad (explantes vivos no contaminados) se ve afectada por el aumento en la tasa de oxidación. Además, el medio sin agente gelificante demostró ser beneficioso para la formación y elongación de brotes.
