ARTÍCULO

Actinomicetos aislados de Argopecten purpuratus productores de enzimas extracelulares y con actividad inhibitoria de patógenos marinos

Extracellular enzymes production and pathogen inhibitory activity of actinomycetes isolated from Argopecten purpuratus

 

Jorge León¹, Juan José Aponte¹, D´Lourdes Cuadra¹, Nadia Galindo¹, Liz Jaramillo¹, Marisol Vallejo² y Emilio Marguet²

¹Laboratorio de Ecología Microbiana, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Av. Venezuela s/n Ciudad Universitaria, Lima, Perú. jorgeleonq@yahoo.com
²Cátedra en Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, Roca 115 (9100), Trelew, Argentina

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ABSTRACT

The present study was aimed at isolating Argopecten purpuratus-associated actinomycetes strains, and evaluating their capacity of production of extracellular enzymes (ECE), as well as inhibitory compounds against relevant pathogens in commercial aquaculture. Twenty seven strains were isolated from the gut of A. purpuratus adult specimens that were collected in the city of Pisco and Pucusana (Lima) _ Peru; 81.5 and 59.2% of the isolates showed proteolytic and lipolytic activity, respectively. In addition, the strains ARG 9-II, ARG 10-II, ARG 12-II and ARG14-II evidenced broad-spectrum antimicrobial activity against the pathogens Vibrio anguillarum, V. vulnificus, V. alginolitycus, Lactococcus garvieae, Streptococcus iniae, Carnobacterium piscícola, and Yersinia ruckeri. The strain ARG 4-II produced the highest inhibitory effect against S. iniae. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the dichloromethane extract obtained from the strain ARG 12-II supernatant was 250 and 500 µg ml^-1 against V. anguillarum and V. alginolyticus, respectively. Based on 16S rRNA sequence analysis, strains ARG 9-II, ARG 12-II and ARG 14-II were identified as Streptomyces variabilis, St. labedae and St. rochei, respectively. Results indicate that A. purpuratus is a promissory source for the isolation of new strains of Streptomyces with high bioactivity and antagonistic capacity against relevant pathogens in aquaculture. These strains have high potential for being developed as probiotic agents in the future.

Key words: Biocontrol, probiotic, Streptomyces, aquaculture, Peru

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RESUMEN

El presente trabajo tiene como objetivos evaluar actinomicetos aislados de Argopecten purpuratus y su capacidad de producir enzimas extracelulares (EEC), así como determinar su actividad antagonista frente a patógenos de importancia en acuicultura. Se aislaron 27 cepas de actinomicetos a partir de la masa visceral de especímenes adultos de A. purpuratus colectados en la localidad de Pisco y Pucusana (Lima) - Perú. El 81,5 y 59,2% de los aislados mostraron actividad proteolítica y lipolítica, respectivamente. Asimismo, las cepas señaladas como ARG 9-II, ARG 10-II, ARG 12-II y ARG 14-II mostraron mayor actividad antimicrobiana contra los patógenos Vibrio anguillarum, V. vulnificus, V. alginolitycus, Lactococcus garvieae, Streptococcus iniae, Carnobacterium piscicola y Yersinia ruckeri. La cepa ARG 4-II exhibió la mayor actividad inhibitoria. La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto diclorometánico de la cepa ARG 12-II frente a V. anguillarum y V. alginolyticus fue calculada en 250 y 500 µg ml^-1 respectivamente. Las cepas ARG 9-II, ARG 12-II y ARG 14-II sobre la base del análisis de su ARNr 16S fueron identificadas como Streptomyces variabilis, St. labedae y St. rochei, respectivamente. Los resultados señalan a A. purpuratus como una fuente promisoria de aislamiento de nuevas cepas de Streptomyces con alta capacidad bioactiva y antagonista contra patógenos de importancia en acuicultura y con posibilidades de ser desarrolladas como potenciales agentes probióticos en el futuro.

Palabras clave: Biocontrol, probiótico, Streptomyces, acuicultura, Perú

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INTRODUCCIÓN

La acuicultura es uno de los sectores productivos con mayor crecimiento y rápida expansión en la industria internacional. Según cifras de la FAO (2014), la industria acuícola para el 2012 produjo alrededor de 90,43 millones de toneladas de productos hidrobiológicos, comprendiendo peces, crustáceos, moluscos entre otros organismos, tanto de agua dulce como de mar. Este desarrollo ha sido muy evidente en los últimos 10 años y Perú ha experimentado un crecimiento importante y sostenido de su acuicultura, la cual alcanzó en el 2013 poco más de 105 mil toneladas, lo cual es superior en 45% con relación al 2012. Del total de las cosechas el 72% de la producción corresponde al ámbito marino, destacando `concha de abanico' Argopecten purpuratus (Lamarck, 1819) y `camarón blanco del Pacifico' Litopenaeus vannamei (Boone, 1931), cuyas producciones son destinadas principalmente a la exportación (PRODUCE 2014)¹.

Uno de los principales problemas de la industria acuícola es la presencia de brotes de patógenos, los cuales suelen diseminarse en gran proporción del cultivo, generando pérdidas cuantiosas (Patil et al. 2001). Por la forma de cultivo, los animales acuáticos están constantemente expuestos a los patógenos ocasionales, los cuales en densidades suficientes pueden provocar la enfermedad (Moriarty 1998). Asimismo, el hacinamiento y las pobres condiciones de cultivo contribuyen a la destrucción del equilibrio `hospedero - patógeno - ambiente', lo que desencadena la aparición de patologías (Das et al. 2008).

Los microorganismos marinos, en particular los actinomicetos, son de considerable interés en biotecnología debido a la capacidad de producir diversos metabolitos secundarios bioactivos con actividad antimicrobiana, antitumoral, inmunoestimulante, antiparasitaria, entre otros (Solanki et al. 2008). Se trata de un grupo de bacterias ambientales, Gram positivas muy prolíficas, cuyo aislamiento a partir de ecosistemas marinos es cada vez más frecuente (Lee et al. 2001, Anand et al. 2006, Gandhimathi et al. 2008, Mahyudin 2008).

El uso de bacterias marinas, en particular de actinomicetos como probióticos en acuicultura, ha sido tema de estudios de los últimos años. Investigaciones previas se llevaron a cabo en diferentes lugares del mundo; existe la experiencia de Riquelme et al. (2000), quienes determinaron la actividad inhibitoria de 3 cepas aisladas a partir de A. purpuratus contra vibrios marinos potencialmente patógenos de peces, moluscos y crustáceos, cuyos resultados fueron prometedores. Patil et al. (2001) lograron aislar Streptomyces a partir de sedimento marino con actividad inhibitoria de patógenos acuáticos como Aeromonas hydrophila, Edwarsiella tarda y Aeromonas sobria, sugiriendo que estos hallazgos podrían ser utilizados en la producción de antibióticos y en futuras aplicaciones como probióticos. Wan & Darah (2005), señalan el aislamiento de Vibrio ruber (S2A1), con actividad antibacteriana muy significativa frente a Gram positivas y Gram negativas, entre ellas algunos patógenos acuáticos. Asimismo, You et al. (2005) reportan el aislamiento de Streptomyces y Micromonospora antagonistas a vibrios patógenos, resaltando además que podrían ser fuentes promisorias de agentes de biocontrol en la acuicultura. El desarrollo de microorganismos probióticos capaces de controlar patógenos en ambientes acuáticos constituye una alternativa biotecnológica para disminuir la mortalidad en cultivos de mariscos de importancia comercial (Irianto & Austin 2002). En este sentido, los actinomicetos marinos se han considerado como posibles biocontroladores, gracias a su alta capacidad de producir metabolitos antimicrobianos y a la vez exoenzimas, que en el medio acuático contribuirían a reducir la presencia de patógenos y la carga orgánica respectivamente (Das et al. 2008), siendo destacada esta actividad en los últimos años por otros autores (You et al. 2005, 2007; Kumar et al. 2006, Das et al. 2006a,b, 2008).

Es aún incierto el uso de actinomicetos marinos asociados a invertebrados en prácticas acuícolas, pero dado los resultados experimentales que se tiene a la fecha, este grupo de bacterias prometen ser útiles en diferentes aspectos de la acuicultura, tales como la sanidad acuícola, la biorremediación de ambientes acuáticos, agentes probióticos y en especial en el control de patógenos en la industria de la larvicultura de A. purpuratus en el marco de una acuicultura ambientalmente amigable y desarrollo sustentable.

Siendo el cultivo de A. purpuratus de gran importancia para el desarrollo de la maricultura peruana, el presente estudio tuvo como objetivo principal contribuir en la selección de actinomicetos nativos aislados del bivalvo A. purpuratus, que mostraran capacidad de producir enzimas extracelulares (EEC) y compuestos antagonistas frente a patógenos potenciales de organismos acuáticos.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Colección de muestras

Especímenes adultos de Argopecten purpuratus, capturados en la zona de Pisco (Ica) y Pucusana (Lima) fueron adquiridos en el muelle de pescadores artesanales de Ventanilla (Callao). Los especímenes fueron congelados y luego traslados al laboratorio para su procesamiento microbiológico inmediato. El tiempo transcurrido entre la colecta de especímenes marinos y el procesamiento de muestras no fue mayor de 24 h.

Aislamiento de actinomicetos

Se procedió a extraer asépticamente la masa visceral de 24 especímenes, los cuales se homogenizaron en agua de mar estéril (membrana de filtración de 0,22 µm de porosidad), luego se realizaron diluciones seriadas al décimo hasta 10^-3. Las dos últimas diluciones se sometieron a shock térmico a 60ºC por 25 min y luego se sembró 0,1 ml de inóculo por diseminación en placas de Agar Marino (modificado) y Agar Almidón Caseína, ambos con adición de cicloheximida (50 µg ml^-1) más ácido nalidíxico (40 µg ml^-1) siguiendo la metodología aplicada por Takizawa et al. (1993). Cada siembra se realizó por duplicado y se mantuvo en incubación a 28ºC hasta por 21 días.

Caracterización morfológica de los actinomicetos

Los actinomicetos aislados fueron caracterizados por su comportamiento cultural en los medios de aislamiento luego de una incubación a 28°C por 10 a 15 días. Se determinó las características de colonia por su tamaño, forma, color, textura, elevación, pigmentación del micelio aéreo y del substrato según Reddy et al. (2011). Las observaciones microscópicas se realizaron principalmente para determinar la tinción Gram, la forma y tamaño celular y sobre todo para observar la ornamentación y disposición de las esporas como estructuras de reproducción, utilizando la técnica de los microcultivos (Williams & Cross 1971).

Actividad enzimática extracelular

La capacidad de producir enzimas extracelulares se realizó según la metodología descrita por León et al. (2000). Brevemente, las cepas aisladas fueron sembradas en un medio de cultivo base preparado con agua de mar y luego suplementado independientemente con sustratos como leche descremada, yema de huevo, tween 80, almidón y gelatina nutritiva, a fin de evaluar la actividad de caseinasa, lecitinasa, lipasa, amilasa y gelatinasa, respectivamente. Las cepas fueron incubadas a una de temperatura de 28°C por 7 días. Para determinar la actividad de caseinasa y lecitinasa se procedió a medir el tamaño de los halos que se observaron como zonas transparentes o de opacidad (según sea el caso) alrededor de cada colonia. Para determinar la actividad amilolítica y proteolítica (gelatinasa) se agregó al medio de cultivo la solución de Lugol y la solución de cloruro mercúrico, respectivamente.

Cepas de patógenos en prueba

Las cepas testigo corresponden a patógenos potenciales de importancia en patología acuícola. Los patógenos Gram negativos fueron Vibrio anguillarum (cepas 01 y 02), V. vulnificus (BT3), V. alginolitycus (038525) y Yersinia ruckeri ATCC 29473, Y. ruckeri (cepas 6, 7 y 8) y los Gram positivos Streptococcus ineae 2378, Lactococcus garvieae 03/8460 (cepa española), L. garvieae 03/8702 (cepa italiana) y Carnobacterium piscicola 4020 (donación hecha por el Dr. José Francisco Fernández-Garayzabal de la Universidad Complutense de Madrid, España)

Pruebas de antagonismo de actinomicetos frente a patógenos

Se determinaron por dos métodos: método I o de `doble capa' según León et al. (2010); y el método II o de `pocillos' según Parente et al. (1994). Para el primer caso, los actinomicetos aislados fueron cultivados en Agar Marino e incubados a una temperatura de 30°C durante 7 días. A continuación, se agregó una segunda capa de medio conteniendo Agar BHI más un cultivo testigo en fase exponencial. Se incubaron a 30°C por 24 h. Pasado el tiempo, se realizaron las lecturas correspondientes observando los halos de actividad antagonista. El método II se aplicó solamente para los actinomicetos que fueron seleccionados por ser los mejores antagonistas a las cepas testigo. Los cultivos fueron puestos a fermentar en Caldo Marino suplementado con almidón (1%) (p/v) y glucosa (0,5%) (p/v) en agitación constante a 180 rpm por 7 días a 28°C. Al cabo de este tiempo fue centrifugado a 4000 rpm por 20 min; luego, 100 µL del sobrenadante de cada cultivo fue colocado sobre pocillos preparados con antelación en placas de agar BHI sembrados previamente con la cepa testigo. Las placas se incubaron a 30ºC por 18-24 h. La presencia de halos de inhibición alrededor de los pocillos fue considerada como resultado positivo de antibiosis. En ambos métodos las pruebas se realizaron por duplicado.

Extracción del compuesto activo y su actividad inhibitoria

La extracción se realizó a partir de actinomicetos que fueron previamente seleccionados por presentar los mejores halos de actividad antagonista frente a las cepas testigo. Los cultivos se realizaron en las mismas condiciones que en el paso anterior. Para la obtención de extractos se utilizó di-clorometano (vv^-1) como solvente orgánico según procedimientos descritos por Zheng et al. (2004). La fase orgánica fue separada y luego evaporada hasta sequedad en un rotaevaporador. El residuo se pesó y re-suspendido en Dimetilsulfóxido (DMSO) al 5% para ser usado posteriormente en la determinación de la actividad antibacteriana frente a especies patógenas de Vibrio.

Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)

Para esta prueba se utilizó como cepa testigo cultivos de V. anguillarum, V. vulnificus y V. alginolyticus mantenidos en Caldo Tripticasa Soya (TSB, Britania) a 30ºC de incubación. Se realizó siguiendo la metodología de pocillos en placas de micro-dilución según NCCLS (2008). Se eligió el extracto diclorometánico del actinomiceto (ARG 12-II) que mostró mayor actividad antagonista a las cepas patrones. El extracto fue re-suspendido en DMSO al 5% para preparar diluciones de 1:2. Muestras (10 µL) de cada dilución fue colocada en pocillos de la microplaca, a los que se adicionó 80 µL de TSB; luego de ser mezclados se agregó 10 µL de la suspensión de las cepas testigo (0,5 de escala Mc Farland). El material se colocó en incubación a 30ºC por 24 h. Transcurrido el tiempo se vertió 20 µL de una solución de Cloruro de Trifenil Tetrazolio (TTC) en cada pocillo, incubando a 30°C por 30 min adicionales. El viraje del medio a rojo indicó crecimiento microbiano. Se usó DMSO al 5% como control negativo y Oxitetraciclina como control positivo.

Identificación genotípica

Tres cepas seleccionadas por su mayor antagonismo frente a las cepas testigo fueron sembrados en TSB, luego incubados en agitación a 30ºC durante 48 h. Los cultivos se centrifugaron a 12000 g a 4ºC durante 5 min y el ADN genómico se extrajo utilizando el kit comercial de purificación Wizard Genomics (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU) siguiendo las instrucciones del fabricante. Mediante la reacción de PCR se amplificó el gen que codifica 16S ARNr con un termociclador Multigene Gradient (Labnet International Inc., Woodbridge, NJ, EE.UU.), usando los cebadores universales para procariotas 27f (5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG- 3') y 1492r (5'- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3', según lo describe DeLong (1992). Ambas hebras de los productos de PCR se secuenciaron utilizando los servicios comerciales de Macrogen Inc. (Seúl, Corea). Las secuencias obtenidas se compararon con las depositadas en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al. 1990). El árbol filogenético fue construido con el programa Mega versión 6 (Tamura et al. 2013) de acuerdo al método estadístico Neighbor-Joining (Saitou & Nei 1987), utilizando el modelo de sustitución de Tamura-Nei y con un valor de bootstrap de 1000 réplicas. Las secuencias para la construcción del árbol filogenético pertenecen a cepas de colección y fueron obtenidas de la base de datos del Ribosomal Database Project y Nacional Center for Biotechnology. Las secuencias de los géneros Corynebacterium, Rhodococcus, Nocardia y Mycobacterium fueron elegidas por su relación filogenética cercana con el género Streptomyces mientras que la secuencia de la cepa Bacillus subtilis fue elegida arbitrariamente como especie por fuera del grupo en estudio.

Las secuencias del gen 16S ARNr de los actinomicetos seleccionados y signados como cepas ARG 14 II (1309 pb), ARG 12 II (1328 pb) y ARG 9 II (1061 pb) fueron depositadas en la base de datos del GenBank bajo los números de acceso KM386827, KM386828 y KM386829 respectivamente.

 

RESULTADOS

Aislamiento de actinomicetos y características de colonias

Se logró aislar y caracterizar un total 27 cepas de actinomicetos, cuyas principales características se describen en la Tabla 1. El morfotipo predominante fue de colonias blanco-grisáceas. En general, el tamaño de las colonias fue relativamente pequeño (promedio de 2 mm de diámetro después de 21 días de incubación a 28°C); sin embargo, en subcultivos posteriores se lograron alcanzar dimensiones mayores (3 a 5 mm de diámetro). La mayoría de los cultivos (66,6%) no presentaron pigmentación difusible en el medio, aunque el marrón tenue y amarillo claro del micelio vegetativo fue muy evidente en algunos cultivos. Todas las cepas crecieron después de 7 días de incubación.

Actividades enzimáticas de los actinomicetos

La producción de enzimas extracelulares (EEC) fue otra característica evaluada en los actinomicetos aislados. La totalidad de los aislados resultaron ser productoras de algún tipo de EEC (Tabla 2); sin embargo, un alto porcentaje muestran tener prioritariamente actividad proteolítica sobre la gelatina (81%) y caseína (51,8%); así como actividad lipolítica sobre tween 80 (59%) y lecitina (37%) del yema de huevo. Asimismo, el 40,7% de los aislados mostraron capacidad hidrolítica sobre el almidón (Fig. 1). En la Tabla 2 se resalta las cepas de actinomicetos con mayor potencial multi-enzimático (ARG 4-II, ARG 5-II, ARG 13-II, ARG 6-III y ARG 3-III), entre ellas destacan ARG 5-II y ARG 6-III las que lograron alcanzar los halos de actividad de mayor tamaño sobre la caseína.

Figura 1. Frecuencia de actinomicetos aislados de A. purpuratus con actividad hidrolítica extracelular
Figure 1. Frecuency of actinomycetes isolated from A. purpuratus with extracellular hydrolytic activity

 

Actividad antimicrobiana de los actinomicetos

De la totalidad de actinomicetos aislados (27), 13 cepas (48%) presentaron actividad antagonista contra al menos una cepa de bacterias patógenas en prueba. Doce aislados (44,4%) mostraron actividad inhibitoria de patógenos Gram positivos (Tabla 3) con halos de actividad de gran tamaño como es el caso de las cepas ARG2 y ARG 14-II que alcanzan los 46 mm de diámetro frente a Lactococcus garvieae (cepa española) y Streptococcus iniae, respectivamente. Se resalta la actividad antagonista de ARG 10-II y ARG 12-II por ser inhibitorios de las 4 cepas de patógenos testigo. El comportamiento antagonista frente a Gram negativos de los actinomicetos aislados se muestra en la Tabla 4. Diez cepas (37%) fueron evaluadas por su carácter inhibitorio frente a especies de Vibrio comúnmente patógenos a organismos marinos, en particular en cultivos de larvas de A. purpuratus. Entre ellas se destacan las cepas ARG 9-II y ARG 12-II (Fig. 2) por ser inhibitorias de las 4 cepas testigo, así como ARG 14-II la que mostró una marcada actividad inhibitoria contra Vibrio vulnificus, con un halo de inhibición de 38 mm de diámetro. En general, ARG 12-II se considera como la de mayor actividad frente a los patógenos en prueba, dado que logró inhibir a la totalidad de 8 cepas indicadoras (Gram positivas y Gram negativas) (Tabla 3 y 4). Los patógenos más sensibles fueron Lactococcus garvieae (cepa española), Vibrio vulnificus y Yersinia ruckeri ATCC 29473. No obstante, Lactococcus garvieae (cepa italiana) mostró mayor sensibilidad frente a ARG2 y ARG3 (halos de inhibición de 46 y 42 mm, respectivamente).

 

Figura 2. Actividad antagonista de actinomicetos ARG 12-II (A) y ARG 9-II
(B) formando halos de inhibición frente a Vibrio anguillarum 02
Figura 2. Antagonistic activity of actinomycetes ARG 12-II (A) and ARG 9-II
(B) forming zones of inhibition against Vibrio anguillarum 02

 

Extracción del compuesto activo y Concentración Mínima Inhibitoria

La Tabla 5 muestra la actividad antibacteriana in vitro de extractos diclorometánicos de tres actinomicetos (ARG 9-II, ARG 12-II y ARG 14-II) que fueron previamente seleccionados en base a su mayor actividad antibacteriana. Como se observa en la Fig. 3, se ratifica el amplio espectro inhibitorio de estos actinomicetos frente a los principales patógenos Gram positivos, así como los Gram negativos en especial frente a V. vulnificus y V. alginolyticus, siendo ARG 12-II y ARG 14-II las cepas con mayor espectro de actividad tal como se muestra en la Fig. 4. La Tabla 6 muestra la CMI del actinomiceto cepa ARG 12-II frente a especies representativos del género Vibrio, destacando la actividad sobre V. anguillarum 01 (CMI de 250 µg ml^-1).

 

Tabla 5. Actividad inhibitoria de extractos diclorometánicos de tres cepas de actinomicetos aisladas de
A. purpuratus frente a ictiopatógenos (Método de difusión en pocillo)
Table 5. Inhibitory activity of dichloromethane extracts of three actinomycete strains isolated from A.
purpuratus against fish pathogenic strains (well diffusion method)

 

Figura 3. Actividad antibacteriana de extractos diclorometánicos de algunos actinomicetos aislados de A. purpuratus
y su efecto inhibitorio (por duplicado) de patógenos de importancia en acuicultura. Cepas: C. piscicola (A);
St. ineae (B); L. garvieae (cepa española) (C) y L. garvieae (cepa italiana) (D)
Figure 3. Antibacterial activity of dichloromethane extracts of some actinomycetes isolated from A. purpuratus and
its inhibitory effect (in duplicate) against pathogens of importance in aquaculture. Strains: C. piscicola (A);
St. ineae (B); L. garvieae (Spanish strain) (C) and L. garvieae (Italian strain) (D)

 

Figura 4. Efecto inhibitorio (por duplicado) de extractos diclorometánicos de
actinomicetos contra los patógenos V. vulnificus (A) y V. alginolyticus (B)
Figure 4. Inhibitory effect (in duplicate) of dichloromethane extracts of actinomycetes
against the pathogens V. vulnificus (A) and V. alginolyticus (B)

 

Tabla 6. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto diclorometánico de
la cepa de actinomiceto ARG 12-II frente a Vibrios marinos
Table 6. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of dichloromethane extracts of
actinomycete strain ARG 12-II against marine Vibrios

 

Identificación molecular y análisis filogenético

La identificación a nivel de especies de las cepas ARG 14 II, ARG 12 II y ARG 9 II se logró sobre la base de la comparación de las respectivas secuencias del gen 16S ARNr con las pertenecientes a cepas de colección existentes en la base de datos de Ribosomal Database Project².

La Fig. 5 muestra el árbol filogenético construido según lo descrito en la parte de materiales y métodos. En ella se aprecia que la cepa ARG 14 II muestra una homología de 99,92% con respecto a la secuencia del gen 16S ARNr de la cepa S. rochei NBRC 12908. En el caso del actinomiceto cepa ARG 12 II la homología fue de 99,92% con respecto a la cepa de colección S. labedae IFO 15864, mientras que en la cepa ARG 9 II se halló una homología del 100% cuando su secuencia fue comparada con la de la cepa S. variabilis JN180216.

 

Figura 5. Árbol filogenético construido según el método estadístico Neighbor-Joining basado en
la relación entre las secuencias del gen ARNr 16S de cepas aisladas desde A. purpuratus (▲) y
especies relacionadas de Streptomyces. Los números internos de los nodos corresponden a
los valores de soporte de bootstrap (≥ 60 %). Entre paréntesis se muestran los números de
acceso al GenBank. La secuencia de gen ARNr 16S de la cepa de Bacillus subtilis fue elegida
arbitrariamente como secuencia externa al grupo. (barra, 0,02 sustituciones por posición de nucleótido)
Figure 5. Phylogenetic tree constructed by Neighbor-Joining method based on the relationship between the 16S rRNA
gene sequences of strains isolated from A. purpuratus (▲) and related species of Streptomyces. The numbers at
internal nodes are bootstrap support values (≥ 60 %). GenBank accession numbers are given in
parentheses. The 16S rRNA sequence of Bacillus subtilis was chosen arbitrarily as the outgroup
sequence. (bar, 0.02 substitution per nucleotide position)

 

DISCUSIÓN

Los actinomicetos son organismos ubicuos en la naturaleza, saprofíticos por excelencia, que utilizan diversas fuentes de carbono y energía para su desarrollo (Williams et al. 1984). Investigaciones previas señalan que los actinomicetos, en especial Streptomyces marinos productores de EEC, son capaces de hidrolizar diferentes polímeros tales como almidón, gelatina, celulosa, caseína o degradar urea. La presencia de actinomicetos productores de EEC en macroorganismos estaría relacionado con el aspecto nutricional de su hospedero, ya que complementaría el metabolismo de aquellos nutrientes poliméricos no aprovechados por su propia digestión (Das et al. 2008).

Estudios similares al presente señalan la presencia de cepas de actinomicetos fuertemente inhibitorios para otros patógenos de peces como Aeromonas hydrophila, A. sobria y Edwarsiella tarda (Patil et al. 2001). Un parámetro de comparación son los halos de inhibición, siendo en el caso del presente trabajo de gran consideración, ocurre con la cepa ARG 14-II frente a Streptococcus ineae (46 mm de zona de inhibición). Otros reportes señalan a Streptomyces y Micromonospora como posibles controladores de bacterias patógenas de peces, algunas de ellas resistentes a antibióticos como V. harveyi, V. fischeri, A. hydrophila y A. sobria; sin embargo, el tamaño de la zona de actividad respecto al presente es menor (28 mm para Micromonospora sp. frente a V. harveyi) (Saravanakumar et al. 2010). Por otro lado, Thirumurugan & Vijayakumar (2013) reportan que de un total de 82 actinobacterias
aisladas de suelo marino, solo 26% presentaron actividad antibacteriana frente a V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. cholerae, Aeromonas sp. y Pseudomonas sp. con zonas de inhibición máximo de 17 mm frente a V. alginolyticus. No se ha reportado literatura referente a la actividad antagonista de actinomicetos marinos frente a bacterias como Streptococcus ineae, Lactococcus garvieae y Carnobacterium piscicola; este grupo de bacterias lácticas forman parte de la microbiota normal de organismos continentales, siendo algunos de ellos patógenos potenciales de peces de agua dulce (Denev et al. 2009).

Los invertebrados marinos han sido considerados como fuentes potenciales de actinomicetos bioactivos; en este sentido Selvakumar et al. (2010), aislaron cepas de Streptomyces a partir de esponjas marinas, cuyos extractos crudos obtenidos con acetato de etilo mostraron amplia actividad antibacteriana frente a patógenos como A. hydrophila, Serratia sp., V. harveyi, V. parahaemolyticus y V. alginolyticus, logrando alcanzar zonas de inhibición mayores a 30 mm (método del disco difusión). En este trabajo, si bien se utilizó el método del pocillo se logró alcanzar hasta un máximo de 22 mm de diámetro (ARG 12-II frente a V. vulnificus).

Trabajos previos similares al presente señalan que los actinomicetos marinos como Streptomyces sp. LCJ94 tienen actividad antagonista contra V. harveyi, V. alginolyticus y V. vulnificus (patógenos de mariscos) cuya CMI de sus extractos crudo de acetato de etilo presentan valores de 250, 500 y 250 µgml^-1 respectivamente (Mohanraj & Sekar 2013). En este sentido, dichos resultados son muy similares al presente estudio (Tabla 6).

Respecto al estudio filogenético de los actinomicetos marinos seleccionados y evaluados en el presente trabajo, estas 3 especies identificadas como Streptomyces rochei, St. labelae y St. variabilis se han descrito en medios terrestres; sin embargo, la bibliografía verifica su aislamiento de ambientes marinos, poniendo de manifiesto la capacidad de estos microorganismos de tolerar y desarrollarse en diferentes ambientes (Thomas et al. 2010, Reddy et al. 2011, Meena et al. 2013). En los trabajos citados se describen además sus propiedades fisiológicas de interés biotecnológico en especial su capacidad de sintetizar metabolitos activos contra potenciales patógenos humanos y/o animales.

En la última década del presente siglo se resalta posibles usos de actinomicetos marinos en otros aspectos de la acuicultura, tales como la producción de antibióticos para ser incorporados en alimentos de camarones para controlar al virus causante de la `mancha blanca' (Kumar et al. 2006) o en el control de biofilms provocados por especies de Vibrio causantes de vibriosis (You et al. 2007).

En trabajos previos realizados por Riquelme et al. (1995) sobre bacterias asociadas a estadios tempranos de A. purpuratus se indica la presencia predominante de bacterias Gram negativas como Pseudomonas, Moraxella y Vibrio, las cuales serían responsables de la disminución larvaria de estos bivalvos en los hatcheries. Por otro lado, Jorquera et al. (2001) resaltan la importancia de la microbiota bacteriana asociada a A. purpuratus no solo por su efecto negativo como patógenos, también por ser benéficos y productores de compuestos bioactivos que promueven un mejor desarrollo especialmente durante su fase larvaria.

Asimismo, trabajos realizados por León et al. (2011) muestran que el sedimento marino es fuente muy importante para el aislamiento de actinomicetos bioactivos; sin embargo, los invertebrados también serían muestras ideales para su aislamiento. El presente es el primer reporte de actinomicetos marinos aislado de A. purpuratus. Este hallazgo confirma que los actinomicetos no solo son microorganismos que predominan exclusivamente en suelos y sedimentos. Diversos estudios muestran la asociación de este grupo microbiano con invertebrados marinos (Mahyudin 2008). Asimismo, en el presente estudio se ha podido apreciar que la capacidad inhibitoria de actinomicetos marinos frente a los patógenos es elevada. La presencia de actinomicetos en el contenido visceral de A. purpuratus sugiere que estas bacterias en su afán de colonizar el epitelio intestinal, producen diferentes metabolitos activos frente a la predominante microbiota Gram negativa incluida especies patógenas de Vibrio. Reportes sobre el control de Vibrio en acuicultura de camarones han señalado que estos patógenos disminuyen cuando incrementa la población de Streptomyces (Das et al. 2006b, You et al. 2005), Las pruebas in vitro no solo ratifica el marcado antagonismo a los patógenos, muestra a la vez la alta capacidad hidrolítica de polímeros sugiriendo como potenciales candidatos a probióticos y a la vez biorremediantes del ecosistema acuático sobre todo en sistemas controlados.

 

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC-Perú) y Ministerio de Ciencia y Tecnología (MINCyT- Argentina), quienes a través de Programa de Investigación en el Marco del Acuerdo de Cooperación Científica-Tecnológica han financiado parcialmente estudios conjuntos e intercambios bilaterales entre Perú-Argentina el año 2011.

 

NOTAS

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²Cole JR, Q Wang, JA Fish, B Chai, DM McGarrell, Y Sun, CT Brown, A Porras-Alfaro, CR Kuske & JM Tiedje. 2014. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research 42(Database issue): D633-D642; <doi: 10.1093/nar/gkt1244> [PMID: 24288368] <http://rdp.cme.msu.edu>

 

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Recibido el 22 junio 2015 y aceptado el 4 de enero de 2016
Editor: Claudia Bustos D.