Standard artificial breeding of the freshwater snail Physa venustula for ecotoxicological evaluation of pesticides was realized. The bioassays were standardized with a breeding protocol of four batches of P. venustula fed with a solution of Cereal Leaves™ plus fishmeal and Chlorella vulgaris in our laboratory. The oviposition had a downward trend through the time. The eggs were hatched between 7 and 14 d under experimental conditions. The average of eggs per capsule was 12.04 ± 10.66 (range= 1 to 45) and the average fecundity percentage was 65.22%. The snails which produced more egg mass had a lower average number of eggs. The Cereal Leaves™ proved to be a more complete diet for the freshwater snail P. venustula compared to the microalgae Chlorella vulgaris. The morphologic characteristics of the eggs and the behavior of the immature forms are described. The rotifer Philodina acutiformis was a biological contaminant that did not permit the normal growth of the eggs in the cultures. The protocol of ecotoxicological assay using P. venustula has the following advantages: wide distribution in the neotropic, reliability, repeatability, high sensitivity in comparison with other snails and short duration of the assay.

Key words: Physa, artificial breeding, snail, laboratory conditions.

Se realizó una crianza artificial estandarizada del caracol de agua dulce Physa venustula Gould para estudios ecotoxicológicos de plaguicidas. Los bioensayos se estandarizaron con el protocolo de crianza con cuatro camadas de P. venustula, alimentadas con una solución de Cereal Leaves® y hojuelas de pescado y Chlorella vulgaris en nuestro laboratorio. La oviposición siguió un patrón descendente a través del tiempo. La eclosión de los huevos fue de 7 a 14 d bajo condiciones experimentales. El promedio de huevos por cápsula fue de 12,04 ± 10,66 (rango = 1 a 45) y el porcentaje promedio de fecundidad fue de 65,22%. En los caracoles que produjeron más masas, éstas contuvieron menor número promedio de huevos. El alimento Cereal Leaves® demostró ser una dieta más completa para el caracol dulceacuícola P. venustula comparado con la microalga Chlorella vulgaris. Se describen las características morfológicas de los huevos y el comportamiento de las formas juveniles. El rotífero Philodina acutiformis se comportó como un agente biológico contaminante que no permitió el desarrollo normal de los huevos en los cultivos. El protocolo de ensayo ecotoxicológico empleando P. venustula presenta las siguientes ventajas: amplia distribución en el neotrópico, confiabilidad, repetibilidad, alta sensibilidad en comparación a otros caracoles y corta duración del ensayo.

Palabras claves: Physa, crianza artificial, caracol, condiciones de laboratorio.

La mayoría de los bioensayos ecotoxicológicos más usados requieren cultivos continuos para el mantenimiento de los organismos vivos para obtener un número de animales saludables en las pruebas de toxicidad (Centeno et al., 1995; Lauth et al., 1995; Trottier et al., 1997). Además, la carencia de estandarización de las condiciones fisicoquímicas de los cultivos de estos organismos biológicos, es la mayor fuente de variación de los resultados en un mismo laboratorio, así como entre laboratorios ecotoxicológicos (Centeno et al., 1995; Wong y Dixon, 1995).

En Perú, en los últimos cinco años, para la evaluación del efecto de plaguicidas y otros tóxicos ambientales en invertebrados no destinatarios de la biota dulceacuícola, se han empleado el cladócero Moina macrocopa (Iannacone y Alvariño, 1999a); el insecto Chironomus calligraphus (Iannacone y Alvariño, 1998, 1999a), el nemátodo Panagrellus redivivus (Iannacone y Gutiérrez, 1999) y el caracol de agua dulce Physa venustula (Iannacone y Alvariño, 1999b). Este último, P. venustula, es un caracol bentónico propio de la región Neotropical, representado en aguas lénticas dulceacuícolas (Vivar et al., 1996, 1998; Iannacone y Alvariño, 1999b). Iannacone y Alvariño (1999b) indicaron que los juveniles de P. venustula son fácilmente manipulables en el laboratorio; además el costo de sus cultivos y su concordancia ecológica lo favorecen frente a otros bioensayos estandarizados (Laamrani et al., 2000).

Sin embargo, aspectos cuantitativos y descriptivos de la biología reproductiva de P. venustula como la descripción de sus huevos, comportamiento de sus formas inmaduras, ritmo de oviposición, el porcentaje de fecundidad en condiciones de crianza artificial se desconocen.

De esta forma, el objetivo específico fue la determinación de algunos aspectos de la biología reproductiva de P. venustula en condiciones de crianza en el laboratorio para su empleo en ensayos ecotoxicológicos por plaguicidas.

Cría estandarizada de Physa venustula

La identificación y la colección de los caracoles dulceacuícolas P. venustula fue descrita por Iannacone et al. (2001). Para llevar a cabo los ensayos de ecotoxicidad fue necesario realizar la crianza de P. venustula, para la obtención de los juveniles de 0 - 72 h. Se realizó la crianza de cuatro camadas, compuestas de 30, 82, 131 y de 50 individuos. La primera camada fue alimentada con el alga Chlorella vulgaris y las tres últimas con una solución compuesta de Cereal Leaves® (Sigma) más hojuelas de pescado (Tetramin ®). A partir de las formas adultas se aislaron individualmente las masas de huevos. Se colocó un individuo adulto en un envase de plástico de 90 mL, conteniendo 15 mL de agua destilada y 0,2 mL de una solución madre compuesta de 0,5 g de "Cereal Leaves ®" (Sigma) y 10 g de hojuelas de pescado. Para la preparación de la solución madre se pulverizaron las hojuelas de pescado en un mortero y se hizo una mezcla homogénea con Cereal Leaves®, se suspendió en 150 mL de agua destilada, para posteriormente filtrarlo con una malla planctónica de 45 m y finalmente se adicionaron 100 mL de agua destilada. Esta solución madre se mantuvo en refrigeración a 6ºC. La frecuencia de alimentación fue una vez al día; 0,2 mL de la solución madre para los individuos adultos y 0,1 mL para la obtención de los juveniles. Estas formas juveniles se obtuvieron de las masas de huevos aisladas a partir de los cultivos de los individuos adultos. Durante toda la etapa de crianza estos especímenes fueron transferidos cada dos días a medios frescos. La temperatura de los medios de cría fueron de 23 ± 2°C.

Además se describieron las características morfológicas de los huevos, el comportamiento de las formas inmaduras, así como algunos problemas de contaminación biológica en el cultivo artificial de P. venustula.

El pH y la conductividad del agua fueron medidos mediante un potenciómetro (Hanna 8417®, Exxon Chemical, Alemania). La determinación de dureza y alcalinidad se realizó empleando los protocolos estandarizados propuestos por la APHA (1989). El oxígeno disuelto se obtuvo por saturación del agua empleada en las crianzas individuales.

Se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) de una vía con el propósito de analizar las diferencias entre el promedio de huevos y el número de masas de huevos producidos por camadas de P. venustula; así como el promedio de huevos y los días continuos de oviposición de P. venustula. El estadístico Chi-cuadrado (c ²) se utilizó para determinar la existencia de diferencias en la proporción de huevos fecundados por camada alimentados con C. vulgaris y Cereal Leaves. Se determinó el grado de significancia, para que en los casos necesarios fuera contrastado a posteriori con la prueba de Tukey HSD. Además, se llevó a cabo una correlación de Pearson entre el número de masas, el número total y el promedio de huevos de P. venustula. El nivel de significancia fue de a = 0,05 (Zar, 1996).

Debido a que la biología reproductiva de P. venustula no se conoce bajo condiciones de laboratorio, describimos algunas características de los huevos y de las formas inmaduras de esta especie. Las masas de huevos recientes se adhirieron a las paredes y a la base del vaso, su consistencia fue viscosa y pegajosa, tenían la forma de una C, con los extremos redondeados, presentando una hendidura en el centro. La forma de los huevos era elíptica - redondeada y eran transparentes. El número de huevos por cápsula fue de 1 a 45 huevos, siendo el promedio 12,04 ± 10,66 (Cuadro 1), durante el seguimiento realizado por 34 días. El promedio de huevos por masa fue bajo debido a que la postura de la primera semana fue abundante (promedio = 16,21 huevos) y el resto de las semanas disminuyó notoriamente con un promedio entre 5,44 y 7,20 huevos por cápsula (Cuadro 2). Según Lobato (1986) el promedio de huevos por cápsula para Physa marmorata fue de 18,05, valor relativamente alto, debido a que cesó la producción de huevos al séptimo día de iniciada la crianza, y el número de huevos varió de 10 a 29 por cápsula. Ambas especies de Physa presentaron altos promedios de huevos por cápsula, lo suficiente como para mantener cultivos viables. La disminución de la postura de huevos para P. venustula fue paulatina por dos factores; el primero fue que la producción de huevos siguió un ritmo descendente a través del tiempo, y el segundo debido a la mortalidad de los organismos adultos. El caracol Lymnaea columella a 24,7ºC produjo un promedio de 28 huevos por masa (Pereira y Magalhaes, 2000).

Cuadro 1. Producción total de masas de huevos de cuatro camadas del caracol dulceacuícola Physa venustula.
Table 1. Total production of egg mass in four batches of the freshwater snail Physa venustula.

En el interior de los huevos los pequeños caracoles mostraron movimientos del pie, área cefálica y de concha, pero también se observaron períodos de inmovilidad; todas sus estructuras eran extremadamente sensibles y frágiles. Al momento de la eclosión en los caracoles dulceacuícolas pulmonados sale un caracol juvenil diminuto, ya completo, con todas sus estructuras claramente identificadas.

El tiempo mínimo que tomó la eclosión del huevo fue de 7 a 14 d bajo condiciones experimentales; antes que ésta se complete, se desarrolla completamente la forma inmadura que ocupa todo el espacio del huevo. Además, se observó que la forma inmadura empuja las paredes del huevo con ligeros golpes del área cefálica ó masa céfalopodal, desgarrándolas. La forma inmadura mostró movimientos coordinados al salir del huevo. De una masa de huevos no todos se desarrollaron en forma homogénea. En algunos la formación del estado inmaduro fue más lento y en otros no se desarrolló, existiendo huevos no viables dentro de la misma cápsula.

Un problema que se observó durante la crianza de P. venustula fue la presencia del rotífero Philodina acutiformis, que se comportó como un agente contaminante, que no permitió el desarrollo normal de los huevos en los cultivos. Este rotífero se encuentra en grandes cantidades en las aguas residuales domésticas de Carapongo (observación personal) y es transportado a los cultivos adherido a las conchas de los caracoles. A pesar de competir por el alimento, este rotífero parece no afectar al caracol adulto, pero puede afectar la masa de huevos en desarrollo. P. acutiformis logra ingresar a la masa de huevos perforando poco a poco su membrana, enseguida ocupa la superficie de éstos, evitando así que se desarrollen totalmente. La función de la masa gelatinosa que envuelve a los huevos es protección contra todo tipo de contaminante exterior o estrés ambiental (Lobato, 1986, 1987; Barnes y Ruppert, 1997); para nuestro caso la protección ofrecida por la masa gelatinosa fue parcial, ya que el rotífero P. acutiformis logró perforarla afectando a los huevos.

La producción de las masas de huevos por el caracol dulceacuícola P. venustula siguió un patrón descendente con relación al promedio de huevos (Cuadro 1) y con relación a la producción total diaria de huevos (Cuadro 2); P. venustula colocó de 1 a 11 masas de huevos por caracol, observándose un mayor porcentaje de caracoles con 1 y 2 masas de huevos, pero estas masas contenían mayor cantidad de huevos. En los caracoles que produjeron más masas, éstas contuvieron menor cantidad total de huevos (r = -0,804; n = 8; P = 0,016) y menor promedio de huevos (r = -0,863; n =8; P = 0,006), a pesar que el número de posturas fue mayor. La postura de las masas de huevos de las cuatro camadas del caracol dulceacuícola P. venustula fue abundante, sobretodo durante los primeros días de crianza (del primer al noveno día), los días siguientes disminuyó considerablemente la postura bajo condiciones de laboratorio. El análisis estadístico para la producción diaria de masas de huevos mostró que hubo diferencias significativas entre los días de crianza (F = 10,727, p = 0,03) (Cuadro 2).

En total 293 caracoles pusieron 329 masas con 3 888 huevos; el porcentaje de fecundidad de la primera camada alimentada con el alga Chlorella vulgaris fue baja, comparada con dos camadas que fueron alimentadas con Cereal Leaves, con la excepción de la tercera camada (c ² = 31,46; grados de libertad = 3; P = 0,002) (Cuadro 3). El porcentaje de fecundidad obtenido para el caracol P. venustula fue 65,22% sin considerar la primera camada alimentada con el alga C. vulgaris y el porcentaje de fecundidad para las cuatro camadas fue 60,59% (Cuadro 3). Las camadas alimentadas con el extracto acuoso Cereal Leaves presentaron un ligero incremento en el número de masas de huevos, en la frecuencia de la ovipostura y en la longevidad de las formas adultas, expresado por el porcentaje de fecundidad de estas camadas (Cuadro 3). Cereal Leaves constituyó una dieta muy apropiada y completa para el caracol dulceacuícola P. venustula; además, demostró ser una dieta apropiada porque contenía alta cantidad de sales evidenciado por el valor de la conductividad (Knight y Waller, 1992).

Cuadro 3. Porcentaje de fecundidad de cuatro camadas del caracol Physa venustula alimentadas con el alga Chlorella vulgaris y Cereal Leaves â .
Table 3. Fecundity percentage of four batches of the freshwater snail Physa venustula fed with the algae Chlorella vulgaris and Cereal Leaves Ô .

Los parámetros físicoquímicos del medio de crianza y del agua destilada empleada se mencionan en el Cuadro 4. El oxígeno disuelto del agua empleada en las crianzas individuales y en los ensayos ecotoxicológicos fue > 8 mg L^-1.

Cuadro 4. Parámetros fisicoquímicos del medio de crianza y del agua destilada.
Table 4. Physicochemical parameters of the rearing medium and the distilled water.

La estandarización de la crianza artificial de los caracoles dulceacuícolas del género Physa como P. acuta y P. girina, ha permitido su empleo adecuado en bioensayos ecotoxicológicos (El-Gindy et al., 1992; Nebeker y Schuytema, 1998; Roses et al., 1999).

Las principales características del bioensayo ecotoxicológico realizado con el caracol dulceacuícola P. venustula, para evaluar plaguicidas, se observan en el Cuadro 5. La realización de los bioensayos estandarizados involucra tres etapas importantes: a) los cultivos estandarizados de los individuos adultos para la obtención de las masas de huevos; b) el cultivo e incubación de las masas de huevos para la obtención de las formas inmaduras que serán empleados en los bioensayos; y c) la realización del bioensayo con 240 organismos bajo condiciones de laboratorio con una temperatura de 23 ± 2°C y a pH neutro, aplicando el diseño en bloque completamente aleatorizado (Iannacone et al., 2001). El análisis estadístico para las repeticiones para cada uno de los ensayos indicó que hay una buena repetibilidad, y para los tratamientos indicó que son diferentes entre ellos, demostrando la validez estadística del trabajo.

Cuadro 5. Condiciones y criterios de aceptabilidad de la prueba de toxicidad aguda con Physa venustula.
Table 5. Conditions and criteria of acceptability of the acute toxicity test with Physa venustula.

Dado el amplio empleo del género Physa en ensayos ecotoxicológicos, presentamos y proponemos el caracol dulceacuícola P. venustula para la evaluación de riesgos ambientales por plaguicidas de suelo, ya que ofrece ventajas que otros organismos no presentan como organismo bioindicador, entre ellas tenemos amplia distribución, diversidad, alta sensibilidad, bajo costo, fácil crianza, fácil manipulación, movilidad limitada, fáciles colección e identificación. La evaluación del riesgo juega un papel crucial en el planeamiento estratégico y ayuda a la sociedad en su determinación de las prioridades ambientales; a través de los ensayos ecotoxicológicos se obtienen valores finales como la concentración letal media (CL₅₀), y a partir de estos valores se puede determinar el nivel de riesgo ó posibles efectos potenciales de los plaguicidas en organismos no destinatarios del ecosistema acuático (Solomon et al., 1996).

El potencial de los invertebrados como organismos bioindicadores en ensayos de toxicidad está ampliamente demostrado; la ventaja principal en investigación ecotoxicológica es la de mostrar los efectos del tóxico a nivel individual y sus consecuencias posteriores para niveles superiores de organización biológica (población y comunidad). Persoone y Janssen (1993) señalaron que 18 grupos taxonómicos de invertebrados son empleados en ensayos de toxicidad, entre ellos se menciona al Phylum Mollusca. De los 18 grupos de invertebrados, sólo los ensayos con cladóceros, como las especies de Daphnia, están muy bien estandarizados y ampliamente difundidos. Persoone and Janssen (1993) mencionaron que 10% de los ensayos ecotoxicológicos emplean moluscos, ya sea marinos ó dulceacuícolas, como organismos bioindicadores. Las especies dulceacuícolas aceptadas por la American Society for Testing Materials como organismos bioindicadores para ensayos de toxicidad son los gasterópodos Physa integra, Physa heterostropha y Amnicola limosa.

Iannacone y Alvariño (1999b) demostraron que el ensayo ecotoxicológico realizado con el caracol dulceacuícola P. venustula presenta alta sensibilidad relativa y eficiencia en la detección de la toxicidad de metales pesados; en nuestro caso también se demuestra que P. venustula es altamente sensible y eficiente para detectar la toxicidad de plaguicidas. El ensayo con P. venustula puede ser considerado dentro de una batería multitrófica para evaluar el impacto ambiental de residuos tóxicos en los ecosistemas dulceacuícolas de una manera global y más acertada (Iannacone et al., 2002). El ensayo con P. venustula presenta las ventajas que mencionan Elder y Collins (1991) para ensayos con moluscos, principalmente sensibilidad y repetibilidad para moluscos gasterópodos y bivalvos como organismos bioindicadores de perturbación medio ambiental.

Comparando el ensayo estandarizado con Daphnia y el ensayo con P. venustula, el primero es un microcrustáceo ampliamente distribuido y presente en muchos hábitats (Thiebaud et al., 1994). Daphnia es un organismo ecológicamente importante ya que son consumidores primarios y constituyen una fuente de alimento para muchas especies de peces y P. venustula es componente del bentos dulceacuícola, agente competidor en el control biológico de otros gasterópodos hospederos de trematodes y bioindicador de la calidad del agua (Iannacone y Alvariño, 1999b). El ensayo con Daphnia presenta alta sensibilidad a un amplio rango de contaminantes acuáticos, P. venustula presenta alta sensibilidad a metales (Iannacone y Alvariño, 1999b) y a plaguicidas. Los valores de la CL₅₀ para especies de Daphnia como D. magna y D. pulex son cercanos a los valores de la CL₅₀ para P. venustula con los plaguicidas evaluados. La crianza de Daphnia y P. venustula no requiere técnicas elaboradas, son realizables y reproducibles bajo condiciones de laboratorio. La población abundante del microcrustáceo Daphnia y del molusco dulceacuícola P. venustula facilitan el muestreo e identificación.

Elder y Collins (1991) mencionaron que la limitada movilidad para moluscos dulceacuícolas y el sedentarismo para el caso de moluscos marinos son características importantes de los moluscos, convirtiéndolos en organismos bioindicadores ideales para proporcionar datos del nivel de contaminación en un área determinada. El empleo de respuestas cuantificables como la CL₅₀ o la concentración efectiva media (CE₅₀) de plaguicidas de suelo en P. venustula permite el análisis de la evaluación del riesgo ecológico de los plaguicidas, en los diversos ecosistemas y de esta forma tomar decisiones dirigidas a la protección ambiental (Iannacone et al., 2001).

1. La oviposición del caracol dulceacuícola P. venustula siguió un ritmo descendente a través del tiempo; durante la primera semana la oviposición fue alta mientras que durante las siguientes semanas disminuyó considerablemente. El promedio de huevos por postura fue 12,04 ± 10,66.
2. El porcentaje de fecundidad de los huevos de caracoles alimentados con Cereal Leaves ® fue 65,22%. El alimento Cereal Leaves demostró ser una dieta más completa que la dieta con la microalga Chlorella vulgaris.
3. El rotífero Philodina acutiformis se comportó como un agente biológico contaminante que no permitió el desarrollo normal de los huevos en los cultivos.
4. La realización de los bioensayos estandarizados empleando al caracol dulceacuícola P. venustula, involucró tres etapas importantes: a) los cultivos estandarizados de los individuos adultos para la obtención de las masas de huevos; b) el cultivo e incubación de las masas de huevos para la obtención de las formas inmaduras que serán empleados en los bioensayos; y c) la realización del bioensayo con 240 organismos bajo condiciones de laboratorio con una temperatura de 23 ± 2°C y a pH neutro aplicando el diseño en bloque completamente aleatorizado.

A los Srs. Manuel Huamán y José Fuertes por su colaboración en el desarrollo de esta investigación.

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