Gayana 66(1): 45-58, 2002

 

ENSAYOS ECOTOXICOLOGICOS CON PETROLEO CRUDO, DIESEL 2 Y
DIESEL 6 CON DOS SUBESPECIES DE BRACHIONUS PLICATILIS
MÜLLER 1786 (ROTIFERA: MONOGONONTA)

ECOTOXICOLOGICAL ASSAY WITH CRUDE OIL, DIESEL 2 AND DIESEL 6
WITH TWO SUBSPECIES OF BRACHIONUS PLICATILIS MÜLLER, 1786
(ROTIFERA: MONOGONONTA)

Marianella Alayo^* & José Iannacone^*

RESUMEN

Se realizó un ensayo estandarizado con el rotífero Brachionus plicatilis rotundiformis línea S y B. plicatilis hepatotomus línea L usándolo como una herramienta para evaluar el ambiente acuático y empleando la fracción soluble en agua (FSA) de tres hidrocarburos: Petroleo Crudo (PC), Diesel 2 (D₂) y Diesel 6 (D₆). Los valores de CL₅₀ determinados para B. plicatilis rotundiformis a 24 y 48 h de exposición de FSA de PC, D₂ y D₆ fueron 0.13, 0.04; 0.65, 0.14 y 4.20, 0.33 mg/L, respectivamente. Los valores determinados de CL₅₀ para B. plicatilis hepatotomus a 24 y 48 h de exposición de FSA de PC, D₂ y D₆ fueron 0.23, 0.05; 1.36, 0.13 y 3.47, 1.01 mg/L, entre los tres hidrocarburos evaluados. El orden de ecotoxicidad disminuyó a 24 y 48 h de exposición para ambas subespecies: petróleo crudo > Diesel 2 > Diesel 6. No se encontró diferencias en la sensibilidad de ambas subespecies de Brachionus. Se propone un protocolo para este bioensayo empleando a B. plicatilis rotundiformis y B. plicatilis hepatotomus como una herramienta para evaluar el ambiente acuático. Esta especie mostró las siguientes ventajas: amplia distribución en el ambiente marino, confiabilidad, repetibilidad, corta duración del bioensayo y alta sensibilidad al compararse con otros dos microcrustáceos: nauplios de Artemia salina y zoeas de Emerita analoga.
Palabras Claves: Ecotoxicidad, rotífero, Brachionus, petróleo, bioensayo, fracción soluble en agua.

ABSTRACT

We conducted standardized ecotoxicological assay with the rotifer Brachionus plicatilis rotundiformis line S and B. plicatilis hepatotomus line L took as tools to evaluate aquatic environment, employing the Water-Soluble Fraction (WSF) of three hydrocarbons: Crude oil (CO), Diesel 2 (D₂) and Diesel 6 (D₆). The values determined of LC₅₀ for B. plicatilis rotundiformis at 24 and 48 h exposure of WSF from CO, D₂ and D₆ were 0,13, 0,04; 0,65, 0,14 and 4,20, 0,33 mg/L, respectively. The values determined of CL₅₀ for B. plicatilis hepatotomus at 24 and 48 h exposure of WSF from CO, D₂ and D₆ were 0,23, 0,05; 1,36, 0,13 and 3,47, 1,01 mg/L, respectively. Among the three hydrocarbons evaluated the order of ecotoxicity decreased at 24 and 48 h exposure for both subspecies were: Crude oils > Diesel 2 > Diesel 6. We did not find differences between the sensibility of both subspecies of Brachionus. We proposed a protocol for the bioassay employing B. plicatilis rotundiformis and B. plicatilis hepatotomus as a tool to evaluate aquatic environment. This specie shows the next advantages: wide distribution in marine environment, trustworthily, repeatedly, short last of the bioassay and high sensibility when we compared microcrustaceans as nauplii of Artemia salina and zoeas of Emerita analoga.
Keywords: Ecotoxicity, rotifer, Brachionus, petrol, bioassays, water- soluble fraction.

INTRODUCCION

Una de las herramientas utilizadas para evaluar el efecto de los contaminantes sobre los componentes biológicos de los sistemas acuáticos son los bioensayos de ecotoxicidad (Rodríguez et al. 1993). Estos nos ayudan a conocer tempranamente, los posibles impactos sobre las comunidades debido a que son utilizados en el monitoreo y control de las perturbaciones en la biocenosis acuática, completando o reemplazando a los métodos analíticos complicados y costosos; Además los bioensayos tienen la ventaja de poder identificar los efectos sinérgicos y antagónicos causados sobre organismos representativos de aguas receptoras imposibles de ser detectados por los métodos analíticos convencionales (Rodríguez et al. 1993; Iannacone et al. 1998b). Estos ensayos han sido recomendados por la Environmental Protection Agency (EPA 1985), como un complemento ideal de las técnicas analíticas empleadas en la evaluación ambiental. En los bioensayos son comúnmente usados miembros de la red trófica acuática, como peces (Segner et al. 1994), artrópodos (Persoone et al. 1994; Idoniboye-Obu 1997) y microalgas (Iannacone & Gutiérrez 1999).

En el ambiente marino la mayoría de los hidrocarburos en el mar son atribuibles principalmente a las operaciones rutinarias de lastre y a los accidentes eventuales de los buques tanqueros (Dorn et al. 1991; Jacinto & Cabello 1999). Tsvetnenko (1998), indica que el Petróleo Crudo (PC) y sus derivados como son el Diesel 2 (D₂) y el Diesel 6 (D₆), perturban las comunidades biológicas, afectando a la conservación de los recursos naturales marinos.

Numerosos estudios han demostrado la importancia de usar una batería de varias especies de diferentes niveles tróficos para evaluar la contaminación acuática, porque la sensibilidad de las especies puede variar dependiendo de las sustancias químicas tóxicas evaluadas (Neff 1987). El zooplancton como componente del ambiente marino, por el tamaño pequeño que presenta, por su ciclo vital corto y por servir como alimento de organismos superiores en la trama trófica, es utilizado frecuentemente en ensayos de toxicidad para evaluar los efectos de los contaminantes químicos causados en los niveles inferiores, observándose sus consecuencias en los niveles superiores de la organización biótica (Persoone et al. 1989; Phan et al. 1994; Widdows 1993b).

Uno de estos organismos son los rotíferos, reconocidos como bioindicadores de la calidad del agua, por su sensibilidad a diferentes tóxicos químicos, por su corto tiempo de vida y su fácil mantenimiento en el laboratorio (Snell & Persoone 1989; Iannacone et al. 1998a).

Brachionus plicatilis Müller es un organismo esencial en el cultivo de muchas larvas de alevines de peces y crustáceos marinos, debido a su importancia nutricional y tamaño; es además, una especie eurihalina y euriterma con distribución cosmopolita en el ambiente marino y poseer una alta tasa de reproducción y un corto tiempo de regeneración (Estévez & Lanas 1988; Coll 1991; May et al. 1987a, 1987b). Se han determinado dos subespecies de B. plicatilis: línea L: B. plicatilis hepatotomus, línea S: B. plicatilis rotundiformis (Fukusho 1989a).

En la literatura algunos ensayos ecotoxicológicos con B. plicatilis muestran resultados con un alto coeficiente de variación para las pruebas de toxicidad aguda y crónica con varios compuestos químicos, debido al empleo de diferentes líneas o subespecies (Snell et al. 1991b), como también sucede cuando se emplean variedades de otros organismos como Artemia salina L. y Daphnia magna (Strauss) de la biota acuática (Snell et al. 1991b; Riveros et al. 1996).

En el rotífero B. plicatilis se tienen escasos datos sobre las diferencias en la sensibilidad entre distintas subespecies. Por lo que los objetivos del presente trabajo fueron evaluar comparativamente la respuesta aguda en dos subespecies del rotífero Brachionus plicatilis hepatotomus (línea S) y Brachionus plicatilis rotundiformis (línea L) a 24 y 48 h de exposición, utilizando el Petróleo Crudo (PC), Diesel 2 (D₂) y Diesel 6 (D₆), y proponer a ambas subespecies como una herramienta ecotoxicológica para evaluar los ambientes acuáticos.

MATERIALES Y METODOS

Identificación y adaptación de Brachionus
Se trabajó con el rotífero B. plicatilis hepatotomus procedente del Japón en 1996, y con el rotífero B. plicatilis rotundiformis procedente de las lagunas de Chilca en 1997, Lima-Perú; ambas subespecies fueron proporcionadas por el Area de Cultivos Marinos del Instituto del Mar del Perú (IMARPE). Posteriormente, se colocaron separadamente en recipientes de plástico circular, de 15 cm de diámetro y 1 litro de capacidad; en agua marina filtrada con mallas de 1m, 5m y 10m y finalmente desinfectadas con rayos ultravioleta (U.V.), y se alimentaron interdiariamente con un inóculo de 37.5 x 10⁴ cel/mL de la microalga marina Nannochloris sp. (Alayo & Iannacone 2001).

Cultivo de Brachionus
Se utilizó la técnica modificada de "Daily-Tank-Transfer" a microescala que consistió en transferir alícuotas de un recipiente de menor volumen (0.25L) a otro de mayor volumen (1L) (Fukusho et al. 1982; Alayo & Iannacone 2001). Se confrontó la densidad óptima del rotífero frente a la concentración de alimento utilizado y a la tasa instantánea de crecimiento, se filtró una parte del cultivo con una malla planctónica (Nytal 67m) y se repuso el cultivo gastado con agua esterilizada U.V. (Hirata, 1984). Ambas subespecies de Brachionus plicatilis se alimentaron con la microalga Chlorophycea Nannochloris sp. con un inóculo de 37.5 x 104 cel/mL La microalga se cultivó con agua U.V. más nutrientes provenientes del medio Guillar (Trujillo & Voltolina 1994).

Parámetros físico-químicos del agua
Se evaluaron la salinidad 34.5 ± 0.5 mg/L, la temperatura 24 ± 3º C, y el pH entre 8 ± 0.6 en los cultivos de B. plicatilis. Las principales características y propiedades del agua (U.V.) a ser utilizada en los cultivos fueron: Nitritos < 0,1 mg/L; Nitratos = 0-12.5 mg/L; pH =7.4 y conductividad = 10.40 mS.

Preparación de las sustancias químicas
Los hidrocarburos se diluyeron con agua U.V. y se mezclaron en una pera de decantación de 1L con 0.3 mL de cada una de las tres sustancias orgánicas Petróleo Crudo (PC), Diesel 2 (D₂) y Diesel 6 (D₆) y se realizó una agitación manual por 15 minutos para obtener La Fracción Soluble en Agua (FSA), a partir de la cual se prepararon las concentraciones para los ensayos ecotoxicológicos. El PC, el D₂ y el D₆ fueron obtenidos de la refinería de Conchan Km 26 de la Panamericana Sur, Lima.

Pruebas ecotoxicológicas
Para todos los casos se realizaron pruebas preliminares para determinar los rangos de las concentraciones ha utilizarse en las pruebas de ecotoxicidad estáticas agudas definitivas, siguiendo las recomendaciones de la APHA (1989). Para el caso de los tres tóxicos se utilizaron las siguientes concentraciones en orden creciente:

En la prueba definitiva aguda se utilizó un diseño en bloques completamente al azar (DBCA): 6 x 4, que consistió en cinco concentraciones o tratamientos más un control o testigo. Por cada concentración se colocaron 40 neonatos entre 0 a 24 h de haber nacido, a partir de hembras partenogenéticas, utilizando un total de 240 individuos, las que previamente fueron colocadas individualmente en placas Petri de plástico de 5 mL para la obtención de los neonatos. Para cada uno de los tres tóxicos los bioensayos se repitieron cinco veces. El ensayo se realizó en envases de vidrio de 3 mL de capacidad. La temperatura de los ensayos fue de 24 ± 3º C.

El punto final de lectura en las pruebas fue la mortalidad, considerándose muertos a los individuos cuando sólo se evidenció la presencia de lórica bajo el microscopio estereoscopio a 15 x. Los tiempos de exposición fueron de 24 y 48 h. Los rotíferos no se alimentaron durante los ensayos ecotoxicológicos, y estos se realizaron bajo condiciones de oscuridad, para evitar el aumento de la actividad natatoria del rotífero (Snell et al. 1991a).

Tratamiento de datos
Se utilizó el modelo estadístico EPA Probit versión 1.5 para el cálculo de la CL₅₀ y los límites de confianza al 99 % a las 24 y 48 h de exposición. Estos valores fueron derivados del análisis de regresión Probit del logaritmo de la concentración del tóxico (en mg/L) y del porcentaje de mortalidad. Sólo los ensayos que resultaron con 90% de sobrevivientes en comparación con el control, se usaron para estimar la CL_50,, según los protocolos propuestos por la APHA (1989) para bioensayos con invertebrados.

La eficacia de las concentraciones se evaluó a través de un Análisis de Varianza (ANDEVA) de una vía con modelo aditivo lineal de un diseño en bloques completamente aleatorizado (DBCA), previa transformación de los datos a raíz cuadrada del arcoseno, con el fin de ajustar los datos a la distribución normal y permitir la homogeneidad de las varianzas, con el propósito de analizar las diferencias entre las concentraciones de la FSA del PC, D₂ y D₆ entre las repeticiones y finalmente entre los tiempos de exposición.

En el caso de existir diferencias significativas entre las réplicas se realizó una Prueba de Significación DVS (Diferencias Verdaderamente Significativas) de Tukey (Daniel 1993). Para la estadística inferencial se recurrió al programa estadístico de computación SPSS versión 7.5 para Window 98.

RESULTADOS

B. plicatilis
Las Tablas I y II muestra los valores de la CL₅₀ y sus límites de confianza a 24 y 48 h de exposición de la FSA del PC, D₂ y D₆ para los rotíferos B. plicatilis rotundiformis y rotundiformis, respectivamente. Además, se muestran los ANDEVA para las repeticiones y para los tratamientos. Las Figuras 1 al 6, indican el porcentaje de mortalidad para cada una de las concentraciones de la FSA del PC, D₂ y D₆ a 24 y 48h de exposición para ambas subespecies, observándose que el porcentaje de mortalidad presenta un patrón ascendente en todos los tiempos de exposición. El orden decreciente de toxicidad observado para la FSA de PC, D₂ y D₆ fue: 48h > 24h.

Tabla I. CL50 del rotífero Brachionus plicatilis rotundiformis al PC, D₂ y D₆ a 24 y 48 h de exposición.
Table I. LC50 with the rotifer Brachionus plicatilis rotundiformis to CO, D₂ and D₆ at 24 and 48 h exposure.

Tabla II. CL50 del rotífero Brachionus plicatilis hepatotomus al PC, D₂ y D₆ a 24 y 48 h. de exposición.
Table II. LC50 with the rotifer Brachionus plicatilis hepatotomus to CO, D₂ and D₆ at 24 and 48 h. exposure.

Figura I. Porcentaje de mortalidad de B. plicatilis rotundiformis con el PC a 24 y 48 h de exposición.
Figure I. Percentage of mortality on B. plicatilis rotundiformis with CO at 24 and 48 h exposure.

Figura II. Porcentaje de mortalidad de B. plicatilis rotundiformis con el D2 a 24 y 48 h de exposición.
Figure II. Percentage of mortality on B. plicatilis rotundiformis with D2 at 24 and 48 h exposure.

Figura III. Porcentaje de mortalidad de B. plicatilis rotundiformis con el D6 a 24 y 48 h de exposición.
Figure III. Percentage of mortality on B. plicatilis rotundiformis with D6 at 24 and 48 h exposure.

Figura IV. Porcentaje de mortalidad de B. plicatilis hepatotomus con el PC a 24 y 48 h de exposición.
Figure IV. Percentage of mortality on B. plicatilis hepatotomus with CO at 24 and 48 h exposure.

Figura V. Porcentaje de mortalidad de B. plicatilis hepatotomus con el D2 a 24 y 48 h de exposición.
Figure V. Percentage of mortality on B. plicatilis hepatotomus with D2 at 24 and 48 h exposure.

Figura VI. Porcentaje de mortalidad de B. plicatilis hepatotomus con el D6 a 24 y 48 h de exposición.
Figure VI. Percentage of mortality on B. plicatilis hepatotomus with D6 at 24 and 48 h exposure.

Evaluación comparativa con otros ensayos ecotoxicológicos

Petróleo crudo
De los tres hidrocarburos evaluados el PC es el más usado en ensayos ecotoxicológicos (Tabla III). El ensayo con B. plicatilis rotundiformis ocupó el segundo lugar y B. plicatilis hepatotomus a 24 h de exposición ocupó el tercer lugar frente 10 individuos inmaduros de la biocenosis acuática. A 48 h de exposición resultaron ser las especies más sensibles.B. plicatilis rotundiformis al ser expuesto a la FSA del PC resultó a las 24 h de exposición 65 veces más sensible que Ctenodrilus serratus (Schmidt), Capitella capitata (Fabricius), Cirriformia spirabrancha (Moore) 60 veces más sensible que Penaeus aztecus Ives, #26 veces más sensible que Palaemonetes pugio Holthius, 56 veces más sensible que Ophryotrocha puerilis Siberti, 42 veces más sensible que Ophryotrocha sp., 1.77 veces más sensible que B. plicatilis hepatotomus y 0.56 veces menos sensible que el decápoda Penaeus monodon Fabricius.B. plicatilis hepatotomus al ser expuesto a la solución soluble en agua del PC resultó ser 36 veces más sensible que los ensayos realizados con C. serratus, C. capitata, C. spirabrancha, 33 veces más sensible que el ensayo realizado con P. aztecus, 31 veces más sensible que O. puerilis, 32 veces más sensible que Ophryotrocha sp., 14 veces más sensible que P. pugio, 0.57 veces menos sensible que B. plicatilis rotundiformis y 0.30 veces menos sensible que P. monodon.

Tabla III. Comparación entre varios organismos marinos en base a la toxicidad aguda CL₅₀ (mg/L) con el rotífero Brachionus plicatilis a 24 y 48 h de exposición frente al petroleo Crudo.
Table III. Comparation among some marine organisms in relation to their acute toxicity LC₅₀ (mg/L) with the rotifer Brachionus plicatis at 24 and 48 h exposure to Crude oil.

ESPECIE INDICADORA		TIPO DE ORGANISMO	CL50 (mg/L)	TE (h)	ESTADIO	REFERENCIA
·	Penaeus monodon	Crustácea	0.07	24	N	Evans et al., 1996
·	B. plicatilis rotundiformis	Rotífero	0.13	24	N	Este estudio
·	B. plicatilis rotundiformis	Rotífero	0.04	48	N	Este estudio
·	B. plicatilis hepatotomus	Rotífero	0.23	24	N	Este estudio
·	B. plicatilis hepatotomus	Rotífero	0.05	48	N	Este estudio
·	Palaemonetes pugio	Crustácea	3.40	24	N	Tatem at al, 1978
·	Ophryotrocha sp.	Anélido	5.52	24	N	Carr & Reish 1977
·	Ophryotrocha puerilis	Anélido	7.36	24	N	Carr & Reish 1977
·	Penaeus aztecus	Crustácea	7.78 7.78	24 24	N N	Tatem et al, 1978 Anderson et al. 1974
·	Capitella capitata	Anélido	8.47	24	N	Carr & Reish 1977
·	Cirriformia spirabrancha	Anélido	8.47	24	N	Carr & Reish 1977
·	Ctenodrilus serratus	Anélido	8.47	24	N	Carr & Reish 1977
·	Ocypode quadrata	Crustácea	0.19	24	A	Jackson et al. 1981
·	Capitella capitata	Anélido	0.84	24	A	Rossi et al. 1976
·	Isochrysis sp.	Microalga	>0.92	24	FE	Evans et al. 1996
·	Menidia menidia	Pez	2.27	24	A	Anderson et al. 1974
·	Neanthes arenaceodentata	Anélido	5.32	48	A	Dillon et al. 1978
·	Paleomonetes pugio	Crustácea	6.86	24	A	Anderson et al, 1974
·	Fundulus similus	Pez	6.94	24	A	Anderson et al. 1974
·	Promysis atlanta	Crustácea	7.38	24	A	Phan et al. 1994
·	Penaeus aztecus	Crustácea	7.78	24	A	Anderson et al.1974
·	Cyprinodon variegatus	Pez	8.08	24	A	Anderson et al. 1974
·	Symbiodinium kawagutii	Microalga	>9.89	24	FE	Anderson et al. 1974
TE= Tiempo de exposición; N =Neonato; A= Adulto; FE= Fase exponencial..

Diesel 2
El ensayo con B. plicatilis rotundiformis a 24 h de exposición ocupó el tercer lugar mientras que B. plicatilis hepatotomus ocupó el octavo lugar frente a ocho individuos de la biocenosis acuática (Tabla IV). En cambio a 48 h resultó ser la especie más sensible.

B. plicatilis rotundiformis al ser expuesto a la FSA del D₂ resultó ser 2.1 veces más sensible que B. plicatilis hepatotomus, 4.9 veces más sefnsible que los ensayos realizados con C. capitata, C. spirabrancha, a su vez resultó ser 2.3 veces más sensible que C. serratus, 1.9 veces menos sensible que P. aztecus, 1.8 veces más sensible que P. pugio,1.6 veces más sensible que Ophryotrocha sp., 1.2 veces más sensible que O. puerilis, 1.3 veces menos sensible que Penaeus setiferus L. y 1.8 veces más sensible que B. plicatilis (Tabla IV).

B. plicatilis hepatotomus al ser expuesto a la solución soluble en agua del D₂ resultó ser 2.0 veces menos sensible que B. plicatilis rotundiformis, 2.4 veces más sensible que los ensayos realizados con C. capitata, C. spirabrancha, a su vez resultó ser 1.1 veces más sensible que C. serratus, 1.1 veces menos sensible que P. aztecus, 1.2 veces menos sensible que P. pugio, 1.3 veces más sensible que Ophryotrocha sp., 1.7 veces menos sensible que O. puerilis, 2.8 veces menos sensible que P. setiferus y 3.9 veces menos sensible que B. plicatilis (Tabla IV).

Tabla IV. Comparación entre varios organismos marinos en base a la toxicidad aguda CL₅₀ (Mg/L) con el rotífero Brachionus plicatilis a 24 y 48 h de exposición frente al D₂.
Table IV. Comparation among some marine organisms in relation to their acute toxicity LC₅₀ (mg/L) with the rotifer Brachionus plicatilis in expositions to D₂ for 24 and 48 h.

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ESPECIE INDICADORA		TIPO DE ORGANISMO	CL50 (mg/L)	TE (h)	ESTADIO	REFERENCIA
·	Brachionus plicatilis	Rotifero	0.345	24	N	Snell et al. 1991
·	Penaeus setiferus	Crustacea	0.48	24	N	Tatem et al. 1978
·	B. plicatilis rotundiformis	Rotifero	0.65	24	N	Este estudio
·	B. plicatilis rotundiformis	Rotifero	0.14	48	N	Este estudio
·	Ophryotrocha puerilis	Anélido	0.81	24	N	Carr & Reish 1977
·	Ophryotrocha sp.	Anélido	1.07	24	N	Carr & Reish 1977
·	Palaemonetes pugio	Crustácea	1.18	24	N	Tatem et al 1978
·	Panaeus aztecus	Crustácea	1.26	24	N	Tatem et al 1978
·	B. plicatilis hepatotomus	Rotífero	1.36	24	N	Este estudio
·	B. plicatilis hepatotomus	Rotífero	0.13	48	N	Este estudio
·	Ctenodrilus serratus	Anélido	1.51	24	N	Carr & Reish 1977
·	Capitella capitata	Anélido	3.20	24	N	Carr & Reish 1977
·	Cirriformia spirabrancha	Anélido	3.20	24	N	Carr & Reish 1977
·	Penaeus setiferus	Crustácea	0.48	24	A	Tatem et al. 1978
·	Skeletonema costatum	Microalga	0.52	24	FE	Mahoney & Haskin 1980
·	Isochrysis galbana	Microalga	0.67	24	FE	Mahoney & Haskin 1980
·	Capitella capitata	Anélido	0.84	24	A	Rossi et al 1976
·	Neanthes arenaceodentata	Anélido	0.87	24	A	Rossi et al., 1976
·	Paleomonetes pugio	Crustácea	1.23	24	A	Anderson et al. 1974
·	Menidia menidia	Pez	1.39	24	A	Anderson et al. 1974
·	Fundulus similus	Pez	1.39	24	A	Anderson et al. 1974
·	Monochrysis lutheri	Microalga	1.42	24	TE	Mahoney & Haskin 1980
·	Lucifer faxoni	Crustácea	1.46	24	A	Lee et al. 1978
·	Dunaliella euchlora	Microalga	>1.64	24	TE	Mahoney & Haskin 1980
·	Elasmopus pectenicrus	Crustácea	1.69	24	A	Lee et al. 1978
·	Penaeus aztecus	Crustácea	1.75	24	A	Anderson et al. 1974
·	Cypronodon variegatus	Pez	2.22	24	A	Anderson et al. 1974
TE= Tiempo de exposición; N=Neonato; A=Adulto; FE= Fase exponencial

Diesel 6
Para los ensayos realizados con B. plicatilis rotundiformis y hepatotomus no se encontraron otros ensayos ecotoxicológicos de comparación (Betton 1993); sin embargo en los resultados obtenidos en el presente trabajo se encontró que B. plicatilis rotundiformis es 1.2 veces menos sensible que B. plicatilis hepatotomus a 24 h de exposición (Tablas I y II). A 48 h B. plicatilis rotundiformis resultó ser numéricamente más sensible que hepatotomus.

Análisis comparativo entre los tres hidrocarburos evaluados

La toxicidad obtenida en términos de la CL₅₀ de los tres hidrocarburos evaluados muestran que para el rotífero B. plicatilis rotundiformis y hepatotomus, PC, D₂ y D₆ fueron más tóxicos a 48 h y menos tóxico a 24 h de exposición (Tablas I y II).

La FSA del PC y del D₂ fue numéricamente más tóxico en B. plicatilis rotundiformis y menos tóxico en B. plicatilis hepatotomus tanto a 24 y 48 h de exposición. La FSA del D₆ fue numéricamente menos tóxico en B. plicatilis rotundiformis a 24 h de exposición y más tóxico en B. plicatilis hepatotomus a 48 h de exposición.

La toxicidad de ambas subespecies a 24 y 48 h de exposición siguen el patrón PC>D₂>D₆. Sin embargo el análisis de la superposición de los límites de confianza para cada uno de los hidrocarburos de las dos subespecies de B. plicatilis y por la prueba de t de Student, muestra en todos los casos que no existen diferencias significativas en la sensibilidad de ambas subespecies.

Secuencia del bioensayo propuesto para el rotífero

Las principales condiciones y criterios de sensibilidad del bioensayo ecotoxicológico realizado con el rotífero en B. plicatilis rotundiformis y B. plicatilis hepatotomus para evaluar los hidrocarburos se observan en la Tabla V.

La realización de los bioensayos estandarizados involucra tres etapas importantes: (1) El mantenimiento de los cultivos estandarizados de los individuos adultos de B. plicatilis rotundiformis y B. plicatilis hepatotomus, (2) la obtención de las formas inmaduras o juveniles y (3) la realización del bioensayo ecotoxicológico con 240 organismos bajo condiciones de laboratorio y a una temperatura de 24 ± 3 °C.

Tabla V. Condiciones y criterios de aceptabilidad de la prueba de toxicidad con B. plicatilis rotundiformis y B. plicatilis hepatotomus.
Table V. Conditions and criterions of acceptability acute toxicity assay with B. plicatilis rotundiformis and B. plicatilis hepatotomus.

DISCUSION

Snell & Janssen (1995) mencionan que muchas variables ecológicas son indicadores de sensibilidad del rotífero Brachionus plicatilis a altos niveles de tóxicos. El aumento de alimento y luz, como menciona Snell et al. (1991b), incrementa su actividad natatoria y un alto gasto energético; por estas razones, el presente trabajo se realizó en condiciones de oscuridad y sin alimentación (Tabla V).

El potencial de los invertebrados como organismos bioindicadores en ensayos de toxicidad está ampliamente demostrado, la ventaja principal de emplear invertebrados en investigación ecotoxicológica es la de mostrar los efectos del tóxico a nivel individual y sus consecuencias posteriores para niveles superiores de organización biológica - población y comunidad (Widdows 1995). Por tales razones los rotíferos juegan un papel importante en el proceso ecológico debido a que contribuyen en la producción secundaria como alimento de invertebrados depredadores, incluyendo larvas de crustáceos (Rodríguez et al. 1993; Gama et al. 1999).

Varias especies de rotíferos han sido empleadas rutinariamente en estudios de toxicidad por diversos autores (Reeve et al. 1976; Snell et al. 1991a; Iannacone et al. 1998a, 1998b). Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que B. plicatilis rotundiformis y hepatotomus son subespecies bastante adecuadas para la realización de ensayos de toxicidad aguda debido a que trabajar con especies aclimatadas y cultivadas en el laboratorio incrementan la sensibilidad a los hidrocarburos evaluados (Crisinel et al. 1994).

En el caso de los resultados obtenidos frente a FSA del PC y D₂, B. plicatilis rotundiformis resultó ser numéricamente más sensible que B. plicatilis hepatotomus, aunque no son estadísticamente diferentes. Muchas líneas o subespecies empleadas pudieran influenciar en los resultados de los ensayos ecotoxicológicos por diferencias en su sensibilidad; sin embargo, puede ocurrir que especies congenéricas Ophryotrocha sp. y O. puerilis y así mismo, entre P. aztecus y P. monodon presenten sensibilidades variables (Carr & Reish 1977; Tatem et al. 1978; Lee et al. 1978).

Trabajos realizados con PC, indican la gran toxicidad que presenta este hidrocarburo frente a los organismos marinos (Phan et al. 1994; Tsvetnenko1998; Reish et al. 1999); a su vez que el D₂ es menos tóxico (Reish 1993) debido a la composición química que presenta, sustento que verifica los resultados obtenidos en esta investigación (Tablas I y II).

Con los resultados obtenidos de PC en términos de CL₅₀ a 48 h de exposición para ambas subespecies de B. plicatilis, la multiplicación por el factor de seguridad de 0.01 para la protección del ambiente acuático marino resulta en valores de rangos 0.4 a 0.5 µg/L, como límites máximos permisibles. En Perú, los hidrocarburos totales disueltos en agua marina han variado entre 0.26 µg/L (Talara) y 18.43 µg/L (Ferrol, Chimbote) en 1996 (Jacinto & Cabello 1999). La UNESCO señala que el valor límite es de 10.0 µg/L para aguas marinas contaminadas (Jacinto & Cabello 1999).

Iannacone et al. (1998b), demostraron que Brachionus calyciflorus presenta una alta sensibilidad relativa y eficiencia en detectar la toxicidad de metales, observándose una mayor sensibilidad que B. plicatilis.

El ensayo con B. plicatilis debiera ser considerado dentro de una batería multitrófica para evaluar el impacto ambiental de hidrocarburos en los sistemas marinos. La estandarización de la crianza es importante, pues permite tener una cohorte de individuos de una misma edad a la eclosión. Si estos organismos no se crían con condiciones definidas, la respuesta frente a las sustancias tóxicas puede variar, disminuyendo la eficacia del bioensayo (Munkittrick et al. 1991).

Rodríguez et al. (1993) consideran que la estandarización de bioensayos involucra la mayor cantidad de variables posibles, que en un momento dado sirvan para garantizar un razonable nivel de repetibilidad de resultados. En este proceso es necesario una adecuada elección de diversos parámetros como selección de especies, sistemas de bioensayos, calidad del agua de dilución. En el presente trabajo de investigación presentamos y proponemos el bioensayo ecotoxicológico con el rotífero eurihalino B. plicatilis, ya que nos muestra ventajas como bioindicador que otros organismos acuáticos no los presentan, entre ellas tenemos una alta sensibilidad, facilidad de uso, costo y concordancia ecológica (Tabla VI) (Crisinel et al. 1994).

En Perú, el Instituto del Mar de Perú (IMARPE), para la evaluación de hidrocarburos en el ambiente marino, usan al crustáceo decápodo Emerita analoga (Simpson) y al camarón salino Artemia salina (Giovanna Vera, IMARPE, comunicación personal).

El criterio de "facilidad de uso" incluye rapidez, simplicidad en el manipuleo, así como en la lectura, disponibilidad del material biológico y volumen de la muestra. Los decápodos permiten realizar pruebas de fácil lectura, pero con manipuleo no muy simple, en comparación con aquellas que emplean rotíferos y microcrustáceos. Brachionus ofrece la misma rapidez que E. analoga y A. salina. La simplicidad de manipuleo y lectura dependen esencialmente del tamaño de los organismos; a mayor tamaño más simple será el método. Por ello, Brachionus al poseer menor tamaño que Emerita presentara mayor dificultad para su manejo. Brachionus presenta buena disponibilidad de material biológico en Perú. El criterio de "costo" incluye lo invertido en materiales y los gastos del trabajo tanto en el cultivo como en la prueba de toxicidad. Usar Brachionus es menos costoso que utilizar Emerita o Artemia (Iannacone & Dale 1999). La "concordancia ecológica" favorece principalmente a Brachionus con respecto a su importancia en las redes tróficas y encontrarse formando parte del ambiente marino y dulceacuícola.

Tabla VI. Evaluación comparativa de tres especies acuáticas empleadas en bioensayos para la detección de hidrocarburos.
Table VI. Comparative evaluation of three aquatic species employed in bioassays to detect hydrocarbons.

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Criterios	Brachionus plicatilis (Rotífero)	Artemia salina (Crustácea)	Emerita analoga (Crustácea)
Sensibilidad	+++*	+	+++
Facilidad de uso
Fácil lectura	++	++	+++
Manipuleo	++	++	+++
Disponibilidad de material biológico	++	+++	++
Rapidez del resultado	+++	+++	+
Volumen de muestra	+++	++	+
Factibilidad de cultivo	+++	+	+
Costo	+++	+++	++
Concordancia ecológica	++	+	+
* puntaje positivo.

CONCLUSIONES

1. El rotífero B. plicatilis rotundiformis presenta mayor sensibilidad, en el ensayo de toxicidad aguda, a la fracción soluble en agua (FSA) del petróleo crudo (PC), y menor sensibilidad a la FSA del Diesel 6 (D₆). El orden decreciente de toxicidad aguda fue: petróleo crudo > Diesel 2 > Diesel 6. Para B. plicatilis rotundiformis, los valores de CL₅₀ a 24 h de exposición a las FSA del PC, D₂ y D₆ fueron 0.13 mg/L, 0.65 mg/L y 4.20 mg/L, respectivamente; y los valores de CL₅₀ a 48 h de exposición a las FSA del PC, D₂ y D₆ fueron 0.04mg/L, 0.14 mg/L y 0.33 mg/L, respectivamente.

2. El rotífero B. plicatilis hepatotomus presenta mayor sensibilidad, en el ensayo de toxicidad aguda, a la FSA, del PC, y menor sensibilidad a la FSA del D₆. El orden decreciente de toxicidad aguda fue: petróleo crudo > Diesel 2 > Diesel 6. Para B. plicatilis hepatotomus, los valores de CL₅₀ a 24 h de exposición a las FSA del PC, D₂ y D₆ fueron 0.23 mg/L, 1.36 mg/L y 3.47 mg/L, respectivamente; y los valores de CL₅₀ a 48 h de exposición a las FSA del PC, D₂ y D₆ fueron 0.05 mg/L, 0.13mg/L y 1.01 mg/L, respectivamente.

3. El ensayo ecotoxicológico propuesto para B. plicatilis, empleando las dos subespecies B. plicatilis rotundiformis y B. plicatilis hepatotomus, como una herramienta para la evaluación de riesgos ambientales, principalmente en el mar, producidos por el petróleo crudo (PC), Diesel 2 (D₂) y Diesel 6 (D₆), puede ser utilizado dentro de una bateria multitrófica, debido a que el ensayo presenta características como: confiabilidad, repetibilidad, alta sensibilidad y corta duración del bioensayo; además su realismo ecológico le favorece frente a otros bioensayos.

4. Para la realización de los ensayos ecotoxicológicos pueden ser empleadas cualquiera de las dos subespecies de B. plicatilis, debido a que ambas muestran respuestas similares, el procedimiento estandarizado con los rotíferos B. plicatilis rotundiformis y hepatotomus se recomienda que se realice a 48 h de exposición, sin alimentación y con un valor de CL₅₀ como punto final.

AGRADECIMIENTOS

A la Blga. Lorena Alvariño F. por las facilidades técnicas brindadas para la realización de este trabajo. A los Blgos. Anita Arrascue, Cecilia Caballero, Javier Sánchez y Kenneth Velásquez.

BIBLIOGRAFIA

Alayo, M. & J. Iannacone. 2001. Crecimiento poblacional del rotífero eurihalino Brachionus plicatilis hepatotomus alimentado con la microalga Nannochloris sp. Bol. de Lima. (Perú) 123: 87-93.

Anderson, J. W., J. Neff, B. Cox, H. Tatem & G. Hightower. 1974. Characteristics of dispersions and water- soluble extracts of crude and refined oils their toxicity to estuarine crustaceans and fish. Mar. Biol. 27: 75-88.

APHA (American Public Health Association), AWWA (American Water Works Association), WPCF (Water Pollution Control Federation). 1989. Standard methods for examination of water and wastewater. Washington, DC, American Health Association. 17ed.

Betton, C. 1993. Oils and Hydrocarbons. p. 244-263. In. Callow, P. (Ed.). Handbook of Ecotoxicology. Vol. 2.

Carr, R. & D. J. Reish. 1977. The effect of petroleum hydrocarbons on the survival and life history and polychaetous annelids. p. 168_173. Fate and Effects of Petroleum Hydrocarbons in Marine Ecosystems and Organisms. Pergamon, New York.

Coll, J. 1991. Acuicultura marina animal. Ediciones Mundi_prensa. Tercera ed. España. 671p.

Crisinel, A., L. Delaunay, D. Rosel, J. Tarradellas, H. Meyer, H. Saiah, P. Vogel, C. Deslisle & C. Blaise. 1994. Cyst-based ecotoxicological tests using anostracans: comparation of two species of Streptocephalus. Environ. Toxicol. Water Qual. 9: 317-326.

Daniel, W. 1993. Bioestadística: Base para el análisis de las ciencias de la salud. Grupo Noriega (Ed.) 667p.

Dillon, T., M. Neff & J.warner. 1978. Toxicity and sublethal effects of Nº 2 fuel oil on the supralitoral isopod Lygia exotica. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 20: 320-327.

Dorn, P., R. Compernolle. & C.H. Meyer, Ch. 1991. Aquatic Hazard assessment of the toxic fraction from the effluent of a petrochemical plant. Environ. Toxicol. Chem. 10: 691_703.

Epa (Environmental Protection Agency). 1985. Methods for measuring the acute toxicity of effluents to freshwater and marine organisms 3rd edition. Peltier, W. & Weber, C. (Ed).

Estévez, A. & M. Lanas. 1988. Efecto de diferentes fuentes alimenticias en la composición de ácidos grasos del rotífero Brachionus plicatilis D.F. Muller. Inv. Pesq. 52: 67-76.

Evans, L., Tsvetnenko, E. & Tsvetnenko, Y. 1996. Ecotoxicology studies in North West Australian Marine Organisms. Final Report, curtin Ecotoxicology Program, Energy Research and Development Corporation.

Fukusho, K. 1989. Biology and mass production of the rotifer, Brachionus plicatilis Int. J. Aq. Fish. Technol 1: 232-240.

Fukusho, K., O. Hara & J. Yosho. 1982. Mass production of rotifers fed Chlorella and yeast in 40-1 tank. Aquacul. 24: 96-101.

Gama, F., M. Sarma & M. Fernández. 1999. Combined effects of Chlorella Density and Methyl Parathion concentration on the population growth of Brachionus calycifiorus (Rotífera). Bull. Environ. Contam. Toxicol. 62: 769_775.

Hirata, H. 1984. Rotifer culture in Japan, cultivation of fish fry and its line food. Europ. Maricul. Soc.: 361-375.

Iannacone, J., L. Alvariño & C. Caballero. 1998a. Ensayos ecotoxicológicos con rotíferos para evaluar el impacto ambiental: El caso de la Cuenca Alta del Río Rimac, Lima _ Perú. IV Congreso Latinoamericano de Ecología. II Congreso Peruano de Ecología.

Iannacone, J., L. Alvariño & W. Dale 1998b. Pruebas ecotoxicológicas como herramientas para la evaluación del impacto ambiental. Bol. de Lima (Perú). 113: 53-68.

Iannacone, J. & A. Gutiérrez. 1999. Ecotoxicidad de los agroquímicos lindano y clorpirifos sobre el nematodo Panagrellus, la microalga Chlorella y el ensayo con Allium. Agri. Téc. (Chile) 59: 85-94.

Iannacone, J. & W. Dale. 1999. Protocolo de bioensayo ecotoxicológico para evaluar metales pesados contaminantes de agua dulce con Chironomus calligraphus (Diptera: Chronomidae) y Moina macrocopa (Crustacea: Cladocera), en el río Rímac, Lima, Perú. Rev. Per. Ent. 41:11-120.

Idoniboye-Obu, B. 1997. Biolectric action potencials of Procambarus acutus acutus (Girrad) in serially diluted solutions of selected C₆ hydrocarbons in water. Environ. Pollut. 14: 5-24.

Jacinto, M.e. & R.J. Cabello. 1999. Niveles de hidrocarburos de petróleo marino costero del Perú. Bahías seleccionadas. Período 1996. Inf. Progresivo IMARPE 110: 1_59.

Jackson, L.T., W. Bidleman & W. Vernberg. 1981. Influence of reproductive activity on toxicity of petroleum hydrocarbons to ghost crabs. Marine Poll. Bull. 12: 63-65.

Lee, W., K. Winters & A. Nicol. 1978. The biological effects of the water-soluble fractions of a Nº 2 fuel oil on the planktonic shrimp, Lucifer faxoni. Environ. Poll. 15: 167_183.

Mahoney, B. & H. Haskin. 1980. The effects of petroleum hydrocarbons on the growth of phytoplankton recognized as food for the eastern oyster, Crassostrea virginica Gmelin. Environ. Poll. 22: 123-132.

May, L., R. Wallace & A. Herzig. 1987a. Production and nutrition of the rotifer Brachionus plicatilis fed marine Chlorella sp. at different cell densites. Hidrobiol. 147: 257-261.

May, L., R. Wallace & A. Herzig. 1987b. Planktonic rotifers and temperature. Hidrobiol. 147: 307-317.

Munkittrick, Kr., Power, E. A. & Sergy, G. A. 1991. The relative sensitivity of microtox, daphnid, rainbow trout and fathead minnow acute lethality tests. Environ. Toxicol. Water Qual. 6: 35-62.

Neff, J. 1987. Biological effects of oil in the marine environment. Chem. Engin. Progress 11. 25 pp.

Persoone, G., A. Van de Vel, M. Van Steertegem & B. de Naver 1989. Predictive value of laboratory test with aquatic invertebrates: influence of experimental conditions. Aquat. Toxicol. 14: 149- 166.

Persoone, G., C. Janssen & W. De Coen. 1994. Cyst based toxicity test X: comparison of the sensitivity of the acute Daphnia magna test and the two crustacean microbiotest for chemicals and wastes. Chemosphere 29: 2701 _2710.

Phan, V., V. Gomes & M. Passos. 1994. Avaiaçao prévia da toxicidade de um efluente similado derivado de petróleo sobre Promysis atlantica (Crustacea, Mysidacea). Bol. Inst. Ocean. Univer. de Sào Paulo. 42: 129-141.

Reeve, M. R., Grice, G.D., Gibson, V.R., Walter, M.A., Darcy, K. & Ikeda, T. 1976. A controlled environmental pollution experiment (CEPEX) and its usefulness in the a study of larger marine zooplankton under toxic stress. In: Pollution studies in controlled ecosystems. 1ra Edición. 145-162p.

Reish, D. 1993. Effects of metals and organic compounds on survival and bioaccumulation in two species of marine gammaridean amphipod, together with a summary of toxicological research on this group. J. Nat. Hist. 27: 781-794.

Reish, D., P. Oshida, A. Mearns & G. Buchman. 1999. Effects of pollution on marine organisms. Water Environ. Research. 71: 1100-1115.

Riveros, A., L. Troncoso, J. Silva, E. Soto, A. Cifuentes, H. Gaete, E. Bay-Schmith. & A. Larrain. 1996. Calidad ecotoxicológica de aguas receptoras de efluentes de industrias pesqueras. Un análisis sinóptico de efectos sobre varias especies, con aguas de Coronel, San Vicente y Rocuant (Región del Bío-Bío, Chile). Gayana Oceanol. 4: 77-91.

Rodríguez, J., M. Correa & M. Escalpez. 1993. Aplicación de técnicas de bioensayos a problemas de contaminación ambiental. AIDIS; Colegio de Ingenieros de Venezuela. Congreso Venezolano de Ingenieria Sanitaria y Ambiental, 7. Caracas 20-25 de junio.

Rossi, S., J. Anderson & G. Ward. 1976. Toxicity of water soluble fractions of four test oils for the polychaetous annelids, Neanthes arenaceodentata and Capitella capitata. Environ. Poll. 10: 9-18.

Segner, H., D. Lenz, W. Hanke & S. Schuurman. 1994. Cytotoxicity of Metals Toward Rainbow trout R1 cell line. Environ. Toxicol. Water Qual. 9: 273-280.

Snell, W. & G. Persoone. 1989. Acute toxicity bioassays using rotifers. 1.A test for brackish and marine environments with Brachionus plicatilis. Aqua. Toxicol. 14: 65-80.

Snell, W., B. Moffat, C. Janssen & G. Persoone. 1991a. Acute toxicity tests using rotifers IV effects of cyst age, temperature and salinity on the sensitivity of Brachionus calyciflorus. Ecotoxicol. Environ. Saf. 21: 308-317.

Snell, W., B. Moffat, C. Janssen & G. Persoone. 1991b. Acute toxicity tests using rotifers III effects of temperature strain and exposure time on the sensitivity of Brachionus plicatilis. Environ. Toxicol. Water Qual. 6: 63-75.

Snell, W. & C. Janssen. 1995. Rotifers in Ecotoxicology: a review. Hydrobiol. 313/ 314: 231-247.

Tatem, H., B. Cox & W. Anderson. 1978. The toxicity of oils and petroleum hydrocarbons to estuarine crustaceans. Estuar. Coastal Mar. Sci. 6: 365-373.

Trujillo, M. & D. Voltolina. 1994. Cultivos de microalgas para la acuicultura. Departamento de acuicultura. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, B.C. Especial 2: 73_85.

Tsvetnenko, Y. 1998. Derivation of Australian tropical marine water quality criteria for the protection of aquatic life from adverse effects of petroleum hydrocarbons. Environ. Toxicol. Water Qual. 13: 273 _284.

Widdows, J. 1993. Marine and estuarine invertebrate toxicity test. p. 145-163. In: P. Callow (Ed.). Handbook of Ecotoxicology. Vol. 1.

*Laboratorio de Ecofisiología, Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad Nacional Federico Villarreal. Calle San Marcos 383, Pueblo Libre, Lima 21- Perú. Telefax: 0514600930. E-mail: joselorena@terra.com

Fecha de recepción: 26.02.02
Fecha de aceptación: 08.04.02