Über den Nachweis von Insulin mit den metachromatisch reagierenden Pseudoisocyaninen

Zusammenfassung

1. Im Cytoplasma der insulinbildenden B-Zellen menschlicher und tierischer Pankreasinseln sowie in dem der sog. dunklen Zellen der Brockmannschen Körperchen der Schleie finden wir Granula, die mit Pseudoisocyaninfarbstoffen nach Oxydation metachromatisch reagieren.

2. Reininsulin sowie alle bei der technischen Insulingewinnung aus Bauchspeicheldrüsen entstehenden insulinhaltigen Fraktionen reagieren mit Pseudoisocyaninen nach Oxydation ebenfalls metachromatisch.

3. Die metachromatische Reaktion des oxydierten Insulins bzw. der B-Zellstrukturen ist auf die Bildung von SO ⁻₃ -Gruppen zurückzuführen. Diese entstehen bei der Perameisensäure- bzw. Kaliumpermanganatbehandlung durch oxydative Aufspaltung der Disulfidbrücken.

4. Mit der Pseudoisocyaninreaktion, deren Durchführung genau beschrieben wird, wird das in den B-Zellen der Langerhansschen Inseln vorkommendeInsulin selbst nachgewiesen.

5. Von den verschiedenen zur metachromatischen Darstellung der B-Zellen geeigneten Pseudoisocyaninen ist das N,N′-Diäthyl-6,6′-dichlorpseudoisocyaninchlorid besonders zu empfehlen, da die mit diesem Farbstoff gefärbten Präparate mit Chloroform entwässert und in Caedax eingedeckt werden können. Auf diese Weise ist die Herstellung von Dauerpräparaten möglich. Das leichter erhältliche N,N′-Diäthylpseudoisocyaninchlorid oder -bromid (Firma AGFA, Leverkusen) kann jedoch genauso verwendet werden, wenn die Präparate nach der Färbung und kurzem Wässern in wasserlösliche Eindeckmittel eingeschlossen werden.

6. Die Pseudoisocyaninreaktion besitzt für den Insulinnach weis einehohe Spezifität. Nur Proteine, bei deren oxydativer Behandlung wenigstens zwei unmittelbar benachbarte SO ⁻₃ -Gruppen (Abstand 4–5 Å) gebildet werden, reagieren metachromatisch. Eine derartige Gruppierung liegt bei der durch die Perameisensäure-Oxydation von Insulin entstehenden Polypeptidfraktion A vor. Fraktion B, bei der die SO ⁻₃ -Gruppen räumlich weit entfernt sind, reagiert negativ. Ebenso ist mit unoxydiertem und oxydiertem Oxytocin, Glutathion und Eieralbumin sowie Aminosäuren, unter ihnen Cystin, Cystein und Cysteinsäure, ihr Oxydationsprodukt, keine metachromatische Reaktion zu erzielen.

7. In den B-Zellen von oxydierten Schnitten durch Pankreasinseln fehlt bei der Färbung mit anderen als metachromatisch bekannten Farbstoffen (Toluidinblau, Methylenblau, Acridinorange) eine metachromatische Reaktion. Dies wird darauf zurückgeführt, daß mit Pseudoisocyanin im Gegensatz zu den anderen metachromatisch wirkenden Farbstoffen bereits beim Vorliegen von Substanzen mit nur zwei oder wenigen negativen Gruppen Metachromasie zu erzielen ist.

8. Die Darstellung von Insulin im oxydierten histologischen Präparat mit Hilfe der Pseudoisocyaninreaktion gelingt nur nach Fixierung mit formalinhaltigen Gemischen, jedoch nicht nach Alkohol- oder Acetonfixierung. Möglicherweise wird Insulin aus alkohol- oder acetonfixiertem Gewebe durch die sauren Oxydationsmittel herausgelöst, da diese Fixierungsmittel lediglich eine Eiweißfällung bewirken. Bei Verwendung von formolhaltigen Gemischen kann dagegen durch Vernetzung von Insulin mit anderen Proteinen ein säureunlösliches Kondensationsprodukt entstehen.

Summary

1. The cytoplasm of the insulin-producing B-cells of the islets of Langerhans contains granula which show a metachromatic reaction after oxidation and colouring with pseudoisocyanins. Such granula can be found in human and mammalian islets, as well as in the insulin-producing tissue of a fish, Tinca vulgaris.

2. Pure insulin as well as all insulin containing fractions obtained during the process of technical isolation of insulin react metachromatically with pseudoisocyanines when oxidized prior to the colouring.

3. The metachromatic reaction of oxidized insulin and of some cytoplasmic structures of B-cells is due to the presence of SO ⁻₃ -groups. They are formed by the splitting of disulphide bonds on treatment with performic acid or potassium permanganate.

4. The metachromatic reaction with pseudoisocyanins, which is described in detail, can be used for thedetection of insulin in the islets of Langerhans.

5. Several pseudoisocyanins can be employed for the histochemical colouring of B-cells. NN′-Diäthyl-6,6′-dichlorpseudoisocyaninchlorid, however, is the most suitable compound since it allows the dehydration of the slides with chloroform after staining. Coverslips can than be mounted with Caedax and the preparates can be made permanent. NN′-Diäthylpseudoisocyaninchlorid, which can be obtained more easily since it is produced commercially by AGFA-Leverkusen, can also be used, but after staining and rinsing in water the slides must be mounted with a water soluble medium.

6. The reaction with pseudoisocyanins ishighly specific for the detection of insulin. Only proteins, which are characterised by at least two closely neighbouring SO ⁻₃ -groups (distance about 4–5 Å) react metachromatically. Such a configuration of SO ⁻₃ -groups occurs in the polypeptide fraction A, which is formed by oxydation of insulin with performic acid. Fraction B does not react metachromatically since its SO ⁻₃ -groups are not located closely enough to each other. No metachromatic reaction is seen after staining of either unoxydized or oxydized oxytocine, glutathione, eggalbumen and amino acids such as cystine, cysteine or its oxydized form, cysteinic acid.

7. B-cells of oxydized slices of pancreatic islets show no metachromasia with other dye stuffs such as toluidine blue, methylen blue and acridine orange, which are commonly known for their metachromatic effects. It is believed that pseudoisocyanine reacts metachromatically already with two negative groups, whereas the other dyes require a greater number of negative groups.

8. Insulin can be characterized in oxydized histological slides only after fixation with formaline-containing solutions, but not after fixation with alcohol or acetone. Since alcohol and aceton merely precipitate the proteins, it can be assumed, that the insulin is eluted by the acidic oxidants when alcohol and acetone have been used for fixation. Formalin on the other hand can react with insulin and other proteins and build up an acid-insoluble condensation product.