Original breve
Validación de un método seguro y sencillo para la elaboración de secuencias consenso del virus de la inmunodeficiencia humana a partir de los datos de secuenciación masiva 454A safe an easy method for building consensus HIV sequences from 454 massively parallel sequencing data

https://doi.org/10.1016/j.eimc.2016.08.008Get rights and content

Resumen

Objetivo

Generar una secuencia consenso a partir de los datos de secuenciación masiva obtenidos en estudios de resistencias a antiretrovirales, que sea representativa de la secuencia Sanger y que sirva para estudios de epidemiología molecular.

Material y métodos

En 62 pacientes se obtuvo la secuencia de transcriptasa reversa-proteasa, mediante Sanger (Trugene-Siemens), y NGS (454GSJunior-Roche). Las secuencias consenso NGS se generaron con Mesquite, seleccionando umbrales 10%, 15% y 20%. Para el estudio filogenético se empleó MEGA.

Resultados

Utilizando el umbral 10%, 17/62 pacientes presentaron secuencias pareadas NGS-Sanger, con una mediana de bootstrap del 88% (IQR 83,5-95,5). La asociación aumenta a 36/62 pacientes y el bootstrap, a 94% (IQR 85,5-98), y alcanza el máximo al 20% en 61/62 pacientes, bootstrap 99% (IQR 98-100).

Conclusión

Mostramos un método seguro para generar secuencias consenso NGS para su uso en estudios de epidemiología molecular procesadas con umbral 20%, de fácil uso y aplicación en los servicios de microbiología clínica.

Abstract

Objective

To show how to generate a consensus sequence from the information of massive parallel sequences data obtained from routine HIV anti-retroviral resistance studies, and that may be suitable for molecular epidemiology studies.

Material and methods

Paired Sanger (Trugene-Siemens) and next-generation sequencing (NGS) (454 GSJunior-Roche) HIV RT and protease sequences from 62 patients were studied. NGS consensus sequences were generated using Mesquite, using 10%, 15%, and 20% thresholds. Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) was used for phylogenetic studies.

Results

At a 10% threshold, NGS-Sanger sequences from 17/62 patients were phylogenetically related, with a median bootstrap-value of 88% (IQR 83.5-95.5). Association increased to 36/62 sequences, median bootstrap 94% (IQR 85.5-98)], using a 15% threshold. Maximum association was at the 20% threshold, with 61/62 sequences associated, and a median bootstrap value of 99% (IQR 98-100).

Conclusion

A safe method is presented to generate consensus sequences from HIV-NGS data at 20% threshold, which will prove useful for molecular epidemiological studies.

Section snippets

Introducción

Recientemente, un buen número de servicios de microbiología clínica han adoptado las técnicas de secuenciación masiva (next generation sequencing [NGS]) para los estudios de resistencias a antirretrovirales en pacientes VIH. La capacidad de NGS en la detección de variantes virales de baja frecuencia se ha determinado en varios estudios1, disminuyendo la sensibilidad en la detección de mutaciones de resistencia hasta niveles del 1% (variantes minoritarias), lo que proporciona ventajas para la

Métodos

Para nuestro estudio hemos utilizado secuencias de 62 pacientes naïve del periodo 2014-2015, nuevos diagnósticos VIH, referidos para estudios de resistencias a antirretrovirales. Las secuencias tipo Sanger se obtuvieron utilizando Trugene®HIV-1Genotyping (Siemens-[NAD]). Para NGS utilizamos el kit GSVType HIV-1 Drug Resistance Primer (Roche) para 454 GS-Junior, partiendo del mismo ARN. Las secuencias consenso de NGS se generan mediante el software Mesquite v. 2.75, seleccionando umbrales de

Resultados

Nuestro estudio ha incluido 62 pacientes VIH-1, naïve, mediana de edad de 37 años (IQR 30-45), carga viral (mediana) 74.900 cp/ml (IQR 20.715-176.250), recuento de CD4 (mediana) 430 células/ml (IQR 48,5-567,78); el 82% eran hombres.

Para evaluar la concordancia entre las secuencias consenso de NGS con diferentes umbrales y la secuencia original de Sanger hemos analizado el número de secuencias que se asocian por pares entre sí, y los valores de bootstrap entre los pares. Utilizando un umbral de corte

Discusión

Los estudios filogenéticos en VIH8, 9, en concreto los estudios de parentesco, dinámica de la epidemia VIH y de subtipado molecular utilizando la secuencia del gen pol, se han utilizado entre otros fines para conocer redes y nodos de transmisión del VIH, así como redes migratorias de los diferentes subtipos. Para estos objetivos la mayoría de los estudios publicados, a nivel internacional10 y a nivel local11, 12, han utilizado la secuenciación de tipo Sanger. Algunos de estos estudios han

Financiación

Fondo de Investigación Sanitaria (PI12/01053, PI15/00713), RD12/0017/006 (Plan Nacional de I+D+I, Fondo Europeo de Desarrollo Regional-FEDER). Federico García disfruta de un Programa de Intensificación de la Actividad de Investigación del Servicio Andaluz de Salud. José Ángel Fernández-Caballero disfruta de un contrato de la RD12/0017/006.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Bibliografía (15)

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Cited by (1)

  • Application of high-throughput sequencing technology in HIV drug resistance detection

    2021, Biosafety and Health
    Citation Excerpt :

    HTS is currently the most commonly used in HIV drug resistance research and drug resistance site detection [7]. Many studies have verified the consistent accuracy in HIV drug resistance detection between NGSs and SS technology [15,16]. Not only can SBS be used in routine clinical testing [15,17], but it can also be applied to large-scale epidemiological investigations [18].

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