Введение
Возросший в последние десятилетия интерес к изучению маркеров сердечно-сосудистого риска (ССР) в значительной мере обусловлен успехами в области биомедицины, включая как достижения фундаментальных наук, так и разработку новых технологий для поиска и изучения биомолекул [1, 2]. Использование традиционных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), включая возраст, пол, артериальную гипертонию, гиперлипидемию, сахарный диабет, и сформированных на их основе шкал в течение многих лет остается неизменным для определения вероятности развития этих заболеваний на популяционном уровне, однако не позволяет оценить риск ССЗ, обусловленных атеросклерозом у отдельного человека [3, 4]. В этом кроется еще одна причина, объясняющая интерес исследователей к изучению биомаркеров.
В идеале биомаркеры, используемые для оценки ССР, могут различаться у разных больных в зависимости от клинической ситуации, наличия коморбидных заболеваний, других индивидуальных показателей. Не умаляя значения традиционных факторов риска, мы должны понимать, что в эру персонализированной и профилактической медицины основная задача формирования новых биомаркеров заключается в улучшении именно индивидуальной оценки вероятности наличия и/или развития заболевания и его прогноза. В частности, внимание исследователей сфокусировано на поиске ответов на вопрос, являются ли ассоциации того или иного маркера с ССЗ достаточно сильными и устойчивыми, чтобы, с одной стороны, улучшить стратификацию риска, а с другой — внести дополнительный вклад в понимание патологических механизмов развития ССЗ и тем самым определить потенциально новые терапевтические подходы.
Различные биомаркеры (от генетических до визуализирующих) обычно отражают активность того или иного биологического процесса; чаще всего используются циркулирующие маркеры, поскольку их легко измерить, а получаемые результаты обычно хорошо воспроизводимы [5—7]. Появление и совершенствование современных биомедицинских технологий дает возможность изучать различные звенья метаболизма, что позволяет понять, насколько вновь появляющиеся биомаркеры важны для клиники. Очевидно, что новейшие инструменты в виде протеомного, метаболомного анализа в сочетании с функциональными и визуальными маркерами можно рассматривать в качестве перспективных кандидатов на биомаркеры [8].
Ранее на основании анализа ряда математических моделей определения риска, полученных на когорте пациентов, которым были выполнены коронароангиография (КАГ) и дуплексное сканирование брахиоцефальных артерий (БЦА), а также широкий спектр биохимических анализов, были сформированы комбинированные биомаркеры оценки риска наличия коронарного атеросклероза и степени его выраженности [9]. В состав этих комплексов вошли визуальные неинвазивные маркеры, характеризующие БЦА: толщина комплекса интима — медиа (ТИМ), количество атеросклеротических бляшек (АСБ), степень стеноза БЦА, а также уровень в сыворотке крови адипонектина и уровень С-реактивного белка, определенный высокочувствительным методом (вчСРБ). Было сделано заключение, что сочетание показателей, получаемых при обследовании пациента с помощью дуплексного сканирования БЦА, с данными об уровне циркулирующих биохимических маркеров позволяет точнее оценить вероятность развития атеросклероза коронарных артерий.
Важным этапом на пути внедрения новых биомаркеров в клиническую практику помимо собственно формирования новых диагностических панелей является оценка их диагностической/прогностической значимости с анализом таких характеристик, как чувствительность, специфичность, правильность прогноза, или их валидация [5]. Валидация, или верификация, биомаркеров предполагает их оценку либо при проспективном наблюдении за исходной когортой (на которой был получен биомаркер), либо на независимой когорте в ходе одномоментного анализа. Несмотря на огромное число параметров, претендующих на роль биомаркеров — кандидатов оценки ССР, лишь немногие прошли этапы клинической и аналитической валидации и были признаны реальными биомаркерами [10].
Цель настоящей работы — провести валидацию предложенных ранее комбинированных биомаркеров, которые были разработаны для оценки вероятности наличия и выраженности атеросклероза коронарных артерий, на независимой когорте пациентов, обследованных аналогично исходной когорте
Материал и методы
Проанализирована когорта пациентов, последовательно поступивших и обследованных в стационаре ФГБУ «НМИЦ ПМ» Минздрава России с 2016 по 2019 г., которым была выполнена процедура диагностической КАГ. Исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Центра.
Критерии включения: пациенты старше 18 лет, подписавшие информированное согласие на включение в исследование и взятие крови на биобанкирование. Критерии невключения: острое клиническое осложнение атеросклероза, произошедшее менее 6 мес назад; любое острое воспалительное заболевание, хроническая болезнь почек III стадии и более (скорость клубочковой фильтрации менее 60 мл/мин/1,73 м2); сахарный диабет обоих типов в стадии декомпенсации; с фракцией выброса левого желудочка менее 40%; онкологические заболевания; заболевания крови и иммунной системы. Пациенты до госпитализации и во время пребывания в стационаре получали необходимые лекарственные препараты в соответствии с их диагнозом и клиническим состоянием.
КАГ проводили по методике Judkins (1967) [11] в условиях рентгеноперационной с использованием ангиографической установки Philips Integris Allura; для количественной оценки стенозов применяли компьютерную программу установки General Electric Innova 4100. Локализацию и степень коронарного атеросклероза оценивали по шкале Gensini (GS) [12]. Обоснованием выбора этой шкалы послужил проведенный нами ранее сравнительный анализ нескольких ангиографических шкал; были предложены отрезные точки, позволяющие детектировать атеросклероз любой степени тяжести (GS>0), а также выделять лиц с выраженным поражением коронарных артерий (GS≥35) [13].
Для оценки состояния БЦА всем пациентам было выполнено дуплексное сканирование с определением ТИМ, наличия АСБ, их количества и высоты максимальной АСБ, с оценкой степени стенозов артерий. Исследование выполнялось в В-режиме с цветовым доплеровским картированием потоков линейным датчиком 9—11 МГц ультразвуковой системы Vivid-7 в положении пациента лежа на спине.
ТИМ измеряли на расстоянии 1 см проксимальнее бифуркации общей сонной артерии [14]. Измерения ТИМ с каждой стороны производили трижды и вычисляли среднее арифметическое значение с каждой стороны. В названных артериях оценивали наличие АСБ. В качестве нормы, предложенной экспертами европейских обществ, выбраны значения ТИМ <0,9 мм [15, 16]. За увеличение ТИМ в БЦА приняты значения от 0,9 до 1,3 мм. Критерием АСБ обозначена ТИМ>1,3 мм или локальное увеличение ТИМ на 0,5 мм (или на 50%) по сравнению с величиной ТИМ близлежащих участков сосудистой стенки [17, 18].
Кровь брали натощак из локтевой вены после 12-часового голодания. Сыворотку крови получали путем центрифугирования (1200g, 15 мин, при 4°C), затем сыворотку разделяли на аликвоты, замораживали и до исследования хранили при температуре –70°C в Биобанке ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России. Пробоподготовку проводили согласно международным стандартам и локальным регламентирующим документам; информационное сопровождение биообразцов осуществляли в соответствии с рекомендациями [19, 20].
Помимо стандартных лабораторных исследований (оценка липидного профиля, уровня глюкозы) в сыворотке крови определяли уровень СРБ высокочувствительным иммунотурбидиметрическим методом (вчСРБ), основанным на взаимодействии СРБ исследуемой пробы со специфическими антителами против СРБ человека, иммобилизованными на поверхности латексных частиц, на биохимическом анализаторе Architec 8000, и уровень адипонектина методом иммуноферментного анализа с помощью наборов BioVendor (Чехия).
Статистический анализ результатов проводили с использованием пакетов статистических программ Statistica 10.0 и SPSS 14.0. Валидность предложенных ранее комбинированных биомаркеров оценивали с помощью однофакторных и многофакторных моделей логистической регрессии с расчетом отношения шансов (ОШ) и 95% доверительных интервалов (ДИ). Уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.
Результаты
В настоящей работе представлены результаты применения комбинированных биомаркеров оценки риска наличия и степени выраженности коронарного атеросклероза на независимой когорте пациентов. Ранее была обследована когорта пациентов (обозначаемая здесь как «исходная») с верифицированными с помощью КАГ наличием коронарного атеросклероза и степенью его тяжести или отсутствием поражения коронарных артерий: 204 пациента, средний возраст 61,2±9,4 года. Был проведен анализ широкого спектра показателей, включая инструментальные (дуплексное сканирование БЦА) и биохимические (липидный спектр, метаболизм висцеральной жировой ткани, показатели воспаления) [9]. Была обнаружена ассоциация ряда биомаркеров и их сочетаний со степенью поражения коронарных артерий; полученные данные легли в основу формирования комбинированных маркеров, позволяющих оценить вероятность наличия и выраженность коронарного атеросклероза.
Комбинированный маркер для неинвазивной оценки наличия атеросклероза (GS>0), сформированный на исходной когорте, включает: мужской пол (ОШ 4,0; 95% ДИ 1,4—11,1; p=0,008), максимальная степень стеноза БЦА более 45% (ОШ 4,6; 95% ДИ 1,0—22,4; p=0,055) и уровень адипонектина в сыворотке крови менее 8,0 мкг/мл (ОШ 2,7; 95% ДИ 1,0—7,1; p=0,04). Чувствительность этого маркера составила 87%, специфичность — 45%, положительная прогностическая ценность — 93%. Комбинированный маркер оценки вероятности выраженного атеросклероза коронарных артерий (GS≥35) включает: ТИМ >0,9 мм, уровень вчСРБ≥3 мг/л и уровень адипонектина в сыворотке крови менее 8,0 мкг/мл; характеризуется довольно низкой чувствительностью (37%), но высокой специфичностью (85%), а прогностическая ценность его положительного результата достигает 70%.
Проверку валидности сформированных маркеров проводили на независимой когорте пациентов, у которых наличие или отсутствие атеросклероза коронарных артерий было верифицировано с помощью КАГ, а изменения в БЦА выявлены с помощью их дуплексного сканирования. Когорта включала 216 пациентов (мужчин 115); средний возраст 61,5±10,73 года, т.е. когорты были сопоставимы по возрасту.
В зависимости от результата КАГ выделяли пациентов с непораженными коронарными артериями (GS<0) и пациентов с клиническими проявлениями атеросклероза, имеющих многососудистое поражение коронарного русла (GS≥35).
Согласно данным регрессионного анализа (табл. 1), наличие коронарного атеросклероза ассоциируется с теми же компонентами комбинированного биомаркера, которые были обнаружены для исходной когорты; при этом связь со стенозом БЦА более 45% в тестируемой когорте оказалась более сильной как в однофакторной, так и в многофакторной моделях: ОШ 8,14 (95% ДИ 2,40—27,63) и ОШ 7,66 (95% ДИ 2,22—26,38) соответственно. В то же время связь со сниженным уровнем адипонектина в однофакторной модели оказалась статистически незначимой.
Таблица 1. Вероятность наличия атеросклероза коронарных артерий любой степени (GS>0) в двух когортах [ОШ (95% ДИ)]
Table 1. Probability of any degree of coronary atherosclerosis (GS>0) in two cohorts [OR (95% CI)]
| Показатель | Исходная когорта (n=204) | Тестируемая когорта (n=216) | ||
| однофакторный анализ | многофакторный анализ | однофакторный анализ | многофакторный анализ | |
| Мужской пол | 4,6 (2,0—10,8) p=0,000 | 4,0 (1,4—11,1) p=0,008 | 2,29 (1,28—4,09) p=0,0048 | 3,16 (1,59—6,29) p=0,001 |
| Степень стеноза БЦА более 45% | 4,5 (1,0—20,2) p=0,046 | 4,6 (1,0—22,4) p=0,055 | 8,14 (2,40—27,63) p=0,0007 | 7,66 (2,22—26,38) p=0,0012 |
| Адипонектин менее 8,0 мкг/мл | 3,0 (1,3—7,1) p=0,011 | 2,7 (1,0—7,1) p=0,040 | 0,71 (0,40—1,25) p=0,23 | 0,45 (0,23—0,90) p=0,023 |
Дальнейший анализ показал, что если у пациента хотя бы один из показателей, входящих в состав комбинированного маркера, удовлетворял вышеуказанным критериям (для маркера, сформированного по данным исходной когорты), то вероятность наличия коронарного атеросклероза (GS>0) была выше в 2,12 раза: ОШ 2,12 (95% ДИ 1,14—3,96; p=0,0175); чувствительность теста составила 78,3%, специфичность — 37,0%; положительная прогностическая ценность оказалась равной 70,9%. При наличии у пациента всех трех показателей, составляющих комбинированный биомаркер, вероятность наличия коронарного атеросклероза (GS>0) была выше в 7,81 раза: ОШ 7,81 (95% ДИ 1,00—61,36; p=0,0493). Низкая чувствительность теста, составившая всего 9,8%, сопровождалась высокой специфичностью — 98,6%; положительная прогностическая ценность достигла 93,3%.
На этой же вновь обследованной когорте пациентов провели и валидацию комбинированного маркера оценки вероятности наличия выраженного атеросклероза коронарных артерий (GS≥35), предложенного в работе [9]. Результаты регрессионного анализа, представленные в табл. 2, также свидетельствуют о наличии в тестируемой когорте ассоциаций показателей, входящих в комбинированный маркер оценки выраженности коронарного атеросклероза, со степенью поражения коронарных артерий.
Таблица 2. Вероятность наличия выраженного атеросклероза коронарных артерий (GS≥35) в двух когортах [ОШ (95% ДИ)]
Table 2. Probability of severe coronary artery atherosclerosis (GS≥35) in two cohorts [OR (95% CI)]
| Показатель | Исходная когорта (n=204) | Тестируемая когорта (n=216) | ||
| однофакторный анализ | многофакторный анализ | однофакторный анализ | многофакторный анализ | |
| ТИМ>0,9 мм | 2,4 (1,1—5,3) p=0,029 | 2,8 (1,2—6,5) p=0,019 | 2,29 (1,28—4,09) p=0,0049 | 2,59 (1,39—4,81) p=0,024 |
| вчСРБ≥3,0 мг/л | 2,7 (1,5—5,0) p=0,001 | 2,5 (1,3—4,7) p=0,007 | 3,25 (1,78—5,93) p=0,0001 | 3,53 (1,89—6,59) p=0,00007 |
| Адипонектин менее 8,0 мкг/мл | 1,8 (1,0—3,3) p=0,049 | 2,0 (1,0—4,0) p=0,039 | 1,61 (0,91—2,86) p=0,10 | 1,51 (0,82—2,78) p=0,18 |
Наряду с этим показано, что хотя бы при одном положительном тесте из трех риск выраженного коронарного атеросклероза (GS≥35) выше в 3,23 раза: ОШ 3,23 (95% ДИ 1,19—8,82; p=0,021). Тест оказался высокочувствительным (93,1%) при невысокой специфичности (19,4%); весьма умеренной оказалась и положительная прогностическая ценность, составившая 36,6%. При наличии у пациента всех трех показателей, составляющих комбинированный биомаркер, вероятность наличия выраженного коронарного атеросклероза (GS≥35) также выше в 3,23 раза: ОШ 3,23 (95% ДИ 1,35—7,74; p=0,008). В этом случае довольно низкой оказалась чувствительность теста (19,4%), в то время как специфичность достигла 93,1%. Положительная прогностическая ценность составила 58,3%.
Обсуждение
Биологические маркеры (биомаркеры) играют существенную роль в биомедицинских исследованиях, в ежедневной клинической практике, а также в разработке лекарственных препаратов, что следует считать одним из приоритетных направлений трансляционной медицины. В связи с этим исследования по поиску новых биомаркеров, оценке их аналитических характеристик, а также подтверждение их прогностической значимости в проспективных исследованиях, прежде чем они будут внедрены в рутинную лабораторную практику, не теряют своей актуальности. Очевидно, что проблема улучшения стратификации ССР с последующей разработкой профилактических мер может быть решена путем поиска новых маркеров, в том числе их различных сочетаний, и формирования мультимаркерных диагностических панелей [1, 6, 9, 21—25]. При этом, как уже было отмечено, любой новый маркер требует верификации (валидации) либо в проспективном исследовании, либо в одномоментных исследованиях на независимых когортах.
Критерии оценки клинического потенциала (валидации) новых биомаркеров предполагают ответ на ряд ключевых вопросов, включая доступность и надежность методов определения нового биомаркера в лабораторной практике и их приемлемую стоимость; наличие диагностической информации, дополнительной к уже имеющейся величине риска, что оценивается по силе ассоциации между новым биомаркером-кандидатом и клиническим состоянием/исходом заболевания, выявляемой в ходе так называемой внешней валидации; понимание того, насколько целесообразно применение нового маркера, т.е. насколько углубленное обследование пациента позволит улучшить диагностику заболевания и/или лечение.
В настоящей работе протестированы предложенные нами ранее комплексные (комбинированные) маркеры наличия и выраженности коронарного атеросклероза, которые были сформированы на основе анализа широкого спектра инструментальных и биохимических показателей. Обоснована пригодность применения указанных комплексов неинвазивных маркеров для дискриминации пациентов с наличием/отсутствием атеросклероза коронарных артерий и в зависимости от степени его тяжести. Согласно полученным данным, несмотря на тот факт, что новая (тестируемая) когорта по тяжести заболевания оказалась легче исходной, оба маркера валидны, т.е. каждая из предложенных ранее комбинаций позволяет статистически значимо отделить как пациентов без изменений на КАГ (GS≤0) от пациентов с любыми изменениями на КАГ (GS>0), так и пациентов без изменений на КАГ или с субклиническим атеросклерозом (GS=0—34) от пациентов с выраженным течением заболевания (GS≥35).
Следует отметить, что модели, предложенные для двух типов разграничений, отличаются по набору переменных, что свидетельствует об изменении биохимических маркеров на разных стадиях развития заболевания. Так, поскольку в патогенезе атеросклероза значительную роль играет хроническое воспаление, неудивительно, что повышенный уровень вчСРБ (≥3,0 мг/л) вошел в состав комбинированного биомаркера, однако это касается только маркера, дискриминирующего более тяжелые стадии заболевания.
Примечательно, что при сравнении когорт, включающих пациентов с выраженным коронарным атеросклерозом, степень ассоциаций в исходной и тестируемой когортах практически одинакова; сохраняется и отсутствие связи между степенью поражения и низким уровнем адипонектина при многофакторном анализе. Возможно, это связано с тем, что в исходной когорте адипонектин рассматривался только как бинарная переменная (т.е. выше или ниже 8,0 мкг/мл). Если же в новой когорте проанализировать непрерывное распределение адипонектина, то выявленная в предыдущих исследованиях статистически значимая ассоциация его низкого уровня с выраженным атеросклерозом подтверждается следующими данными: медиана (Ме [Q25; Q75]) уровня адипонектина в группе GS<35 равна 9,87 [6,19; 11,45], а в группе GS≥35 — 7,84 [4,71; 10,50] (p=0,004, критерий Манна—Уитни). Косвенным подтверждением этой ассоциации является также тот факт, что средняя окружность талии пациентов в группе GS<35 составила 91,63±12,53 см, а в группе GS≥35 — 95,90±11,19 см (p=0,015, непарный t-критерий Стьюдента).
В последнее время становится очевидным, что создание комплексов (комбинаций, сочетаний) нескольких маркеров, т.е. формирование так называемых мультимаркерных панелей, обладает определенным преимуществом по сравнению с измерением и анализом индивидуальных показателей, хотя до создания оптимальных мультимаркерных диагностических комплексов пока далеко [21—27]. Формирование и использование мультимаркерных диагностических/прогностических панелей позволяет интегрировать информацию о патофизиологически различных процессах, которые вовлечены в атерогенез, а отдельные биомаркеры служат субстратом продолжающихся исследований в направлении поиска оптимальных комбинаций, которые характеризуют пациентов с атеросклерозом. Мультимаркерный подход был протестирован в ряде исследований [24, 25, 27—31]. В частности, было показано, что в тех случаях, когда исходно невысокая корреляция между отдельным маркером и заболеванием или его факторами риска существенно возрастает при их комбинации, этот подход оказывается весьма перспективным [4, 31, 32].
В ходе верификации комбинированных биомаркеров нам удалось подтвердить полученные на исходной когорте данные о том, что при наличии у пациента отклонения от пороговых значений хотя бы одного из компонентов, входящих в состав комбинированного биомаркера, его чувствительность достаточно высока при сравнительно невысокой специфичности. В то же время при анализе данных обследований пациентов, имеющих отклонения от пороговых значений по всем трем составляющим комбинированного биомаркера, чувствительность последнего резко падает, а специфичность существенно возрастает, превышая 90%. Действительно, на тестируемой в настоящем исследовании когорте в группе пациентов с GS=0 (против пациентов с GS>0) практически у всех (72 из 73) комбинированный маркер свидетельствовал об отсутствии коронарного атеросклероза. Аналогичная ситуация наблюдалась и при сравнении групп с GS<35 и GS≥35: из 144 пациентов с GS<35 у 134 не было отклонений от пороговых значений всех трех составляющих комбинированного биомаркера, т.е. они не имели выраженных поражений коронарных артерий и могли быть исключены из группы высокого риска.
Данные исследований с включением в модели нескольких биомаркеров позволяют предположить, что объединение показателей, отражающих различные стадии патогенеза заболевания, в одну общую панель (панели) может улучшить стратификацию риска пациентов, страдающих ССЗ, в основе которых лежит атеросклероз. Использование новых технологий, включая протеомный и метаболомный анализ, представляется вполне перспективным и многообещающим. Наряду с этим определенное место занимает и подход, используемый в настоящем исследовании, когда комбинированные мультимаркерные панели формируются на основе общепринятых, используемых в практическом здравоохранении исследований и измерений, включая неинвазивное дуплексное сканирование БЦА и количественное определение в сыворотке крови биохимических показателей, входящих в состав биомаркеров: уровня вчСРБ и уровня адипонектина (в настоящее время проводится анализ возможности включения в модель логистической регрессии величины окружности талии в качестве замены уровня адипонектина).
Таким образом, идентификация новых биомаркеров и их верификация могут дать информацию о молекулярных и патофизиологических механизмах развития острых и хронических ССЗ [4, 6]. Очевидно, что использование биомаркеров позволит проводить более раннюю оценку ССР и обеспечит его более точное прогнозирование. Несмотря на все ограничения, которые сопровождают изучение новых биомаркеров, в том числе комбинированных, и их внедрение в клиническую практику, возможность их использования в качестве потенциальных терапевтических мишеней представляется весьма заманчивой. Иными словами, новые биомаркеры и/или их комплексы вполне могут занять определенную нишу как в качестве вспомогательных неинвазивных диагностических инструментов, так и в качестве новых потенциальных молекулярных мишеней.
Заключение
На основе анализа широкого спектра инструментальных и биохимических показателей на независимой когорте пациентов проведена валидация (проверка) предложенных ранее комбинированных маркеров наличия и выраженности коронарного атеросклероза. Если пациент — мужчина, по итогам дуплексного сканирования у него выявлен стеноз БЦА более 45%, а уровень адипонектина составляет менее 8,0 мкг/мл, вероятность наличия коронарного атеросклероза (GS>0) возрастает почти в 8 раз. О высоком риске выраженного коронарного атеросклероза (GS≥35) свидетельствует сочетание у пациента любого пола значения ТИМ БЦА>0,9 мм, уровня вчСРБ≥3,0 мг/л и уровня адипонектина менее 8,0 мкг/мл. В таком случае вероятность наличия выраженного коронарного атеросклероза повышается более чем в 3 раза. Оба маркера характеризуются довольно низкой чувствительностью — 9,8% для диагностики атеросклероза любой степени и 19,4% для выраженного атеросклероза, но обладают высокой специфичностью — 98,6% и 93,1% соответственно, что позволяет исключить из группы повышенного/высокого риска лиц, не имеющих любых или выраженных поражений коронарных артерий.
В то же время совершенно очевидно, что для практического использования предлагаемых тестов необходима их дальнейшая валидация — оптимизация либо в ходе проспективного наблюдения за исходной когортой, либо на других независимых когортах лиц, у которых наличие и степень атеросклероза коронарных артерий верифицированы с помощью КАГ.
Участие авторов: концепция и дизайн исследования — В.А. Метельская, Н.Е. Гаврилова; сбор и обработка материала — М.В. Жаткина, Н.Л. Богданова, О.А. Литинская, М.С. Покровская; статистическая обработка — Е.Б. Яровая; написание текста — В.А. Метельская, Е.Б. Яровая; редактирование — О.М. Драпкина.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.