Введение
Псориаз (ПС) является хроническим генетически детерминированным дерматозом мультифакториальной природы, характеризующимся гиперпролиферацией эпидермальных клеток, нарушением дифференцировки кератиноцитов, воспалительной реакцией в дерме и изменениями в органах и тканях [1]. В последние годы ПС рассматривается как комплексное заболевание, сочетающее признаки аутовоспалительного и аутоиммунного процессов. Доказано, что провоцирующими факторами, способствующими возникновению ПС или прогрессированию уже существующего псориатического процесса у лиц с генетической предрасположенностью, являются хронический стресс, травматизация кожи, воздействие ультрафиолета, ожоги, инфекции и др. [2, 3].
Понимание механизмов патогенеза ПС является актуальной проблемой. Долгое время оставался спорным вопрос о том, какой патологический процесс при ПС считается первичным: активация иммунной системы или нарушение пролиферации и дифференцировки ке-ратиноцитов. S.L Gottlieb и соавт. выдвинули гипотезу о ведущей роли иммунной системы в патогенезе ПС [5]. В ходе дальнейших исследований было выявлено, что аномальная пролиферация кератиноцитов индуцируется под действием цитокинов - интерлейкина(ИЛ)-17 и ИЛ-22, вырабатываемых активированными Th17-и Тh22-клетками соответственно. Этот патогенетический механизм считался доминирующим [6-9]. Однако в последние годы все большее внимание уделяется роли врожденного иммунитета в патогенезе ПС. Ключевыми рецепторами системы врожденного иммунитета являются паттерн-распознающие рецепторы (PRR - pattern recognition receptors), которые воспринимают экзогенные сигналы опасности PAMP (pathogen-associated molecular pattern) и эндогенные сигналы опасности DAMP (damage-associated molecular pattern) [10]. Активация эндосомальных TLRs, к которым относят TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, является первым сигналом к индукции синтеза молекул-предшественников провоспалительных цитокинов про-ИЛ-1β и про-ИЛ-18, играющих важную роль в развитии псориатического воспаления.
К суперсемейству PRRs также относится семейство NOD-подобных рецепторов (NOD-like receptors, NLRs), которые активируются после распознавания сигналов опасности, олигомеризуются и запускают сборку ин-фламмасомного комплекса. После этого происходит активация каспаз путем протеолитического расщепления. Каспазы осуществляют превращение молекул предшественников цитокинов про-ИЛ-1β и про-ИЛ-18 в биологически активные формы. Кроме того, инфламмасома активирует редкую провоспалительную форму клеточной гибели - пироптоз [11].
В последние годы появились исследования о вовлечении в псориатический процесс инфламмасомных комплексов NLRP1 и NLRP3, однако точный механизм их участия в патогенезе до сих пор не выяснен [12, 13]. Также к настоящему времени не проведено комплексных исследований, позволяющих оценить вклад комплексов NLRP1 и NLRP3 в развитие псориатического воспаления и расшифровать механизмы патогенеза ПС. Исследование молекулярных механизмов функционирования системы врожденного иммунитета позволит выявить новые подходы к прогнозу и разработке таргетной терапии ПС. В связи с вышесказанным цель данной работы - исследование роли инфламмасомных комплексов NLRP3 и NLRP1 в развитии воспаления в псориатическом очаге у больных ПС.
Материал и методы
В исследование включены 32 человека. Основную группу составил 21 пациент с диагнозом ПС тяжелой и среднетяжелой степени тяжести (средний возраст -36 ± 15). Группу сравнения составили 11 здоровых доноров (средний возраст - 26 ± 5). Всего было исследовано 53 образца кожи, из них 42 образца - биоптаты пораженных (n = 21) и непораженных (п = 21) участков кожи пациентов с ПС, а также 11 образцов кожи здоровых доноров. Материал был предоставлен М.М. Гитиновой (заведующий кафедрой - д-р. мед. наук, проф. Э.А. Баткаев).
Критерии включения в группу: возраст пациента от 20 до 65 лет; наличие у пациентов средней или тяжелой степени тяжести псориатического процесса; индекс PASI > 10 (Psoriasis area and severity index); длительность течения кожного процесса от 2 до 5 лет; письменное согласие пациентов на участие в исследовании.
Критерии исключения: возраст моложе 20 и старше 65 лет; наличие тяжелой соматической патологии, у женщин - беременность; наличие аллергических, аутоиммунных, острых и хронических заболеваний в стадии обострения на момент взятия материала.
Клиническое исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации "Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека" (WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013), Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Минздрава России № 266 от 19.06.2003. Все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с протоколом, одобренным локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.
В ходе работы был исследован уровень экспрессии генов семейства TLR - TLR7 и TLR9, являющихся важными распознающими рецепторами во врожденном иммунитете, инфламмасомных комплексов NLRP3 (NLRP3, ASC, CASP1) и NLRP1 (NLRP1, CASP5), а также провоспалительных цитокинов ИЛ-1Р и ИЛ-18 (IL1B, IL18) в биоптатах кожи пациентов разных групп. Взятие биоптатов из пораженного очага и из участков здоровой кожи проводили с помощью дерматологического пробойника. После взятия биопсии образцы кожи погружали в физиологический раствор. Важно отметить, что взятие биопсии с применением дерматологического пробойника обеспечивает содержание в образце клеток всех слоев кожи [14].
Полученные образцы кожи фрагментировали пинцетом и помещали в лизирущий раствор, далее выделяли РНК с использованием набора для выделения ДНК/РНК методом аффинной сорбции на частицах силикагеля "АмплиПРАЙМ Рибосорб" ("ИнтерЛабСервис", Россия) в соответствии с протоколом производителя. Полученную РНК хранили при -70 °С. Далее с помощью набора для проведения реакции обратной транскрипции (ОТ) ("Синтол", Россия) проводили реакцию ОТ для получения кДНК на основе выделенной матричной РНК. Полученную кДНК использовали для постановки полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ), которую проводили, используя набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBRGreenI и праймеров, синтезированных фирмой "Синтол" (Россия). Экспрессию целевых генов нормализовали на ген домашнего хозяйства ACTB, кодирующий β-актин, оценивали по методу AACt [62]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2016 и Statistica 10.0, для построения графиков использовали программу GraphPad® Prism (США).
Результаты
На первом этапе исследования нами были оценены уровни экспрессии генов TLR7 и TLR9 в образцах пораженной и непораженной кожи при ПС и сравнены с соответствующим показателем в образцах кожи из доноров группы сравнения. Выбор генов этих рецепторов обусловлен тем, что эндосомальные TLR7 и TLR9 распознают эндогенные сигналы опасности, в частности ауто-РНК и ауто-ДНК, которые являются аутоантигенами при ПС. Взаимодействие данных рецепторов с лигандами может быть первым сигналом для активации инфламмасомных комплексов NLRP1 и NLRP3.
Было выявлено, что экспрессия генов TLR7 и TLR9 в биоптатах пораженной кожи больных ПС значимо выше, чем в биоптатах здоровой кожи группы сравнения в 1,7 (р = 0,034) и 4,8 раза (р = 0,000329), соответственно. Также был проведен сравнительный анализ экспрессии генов TLR7 и TLR9 в клетках непораженной кожи больных ПС и в клетках здоровой кожи доноров группы сравнения. В биоптатах непораженной кожи при ПС отмечается достоверное повышение экспрессии гена TLR9 в 4,3 раза (р = 0,00124). При этом не выявлено достоверного увеличения экспрессии TLR7 (р = 0,8) (рис. 1).
Рис. 1. Экспрессия генов TLR7 и TLR9 в биоптатах пораженной и непораженной кожи больных псориазом и здоровой кожи доноров группы сравнения (здесь и на рис. 2, 4 графики представлены в логарифмических координатах)
Необходимо отметить, что при сравнении уровней экспрессии генов TLR7 и TLR9 в клетках псориатического очага и в клетках непораженной кожи больных не выявлено значимых различий (р = 0,165 и р = 0,11, соответственно), что указывает на системность прогрессирования заболевания, характеризующееся распространением площади поражения кожи.
Далее нами была изучена экспрессия генов, кодирующих компоненты инфламмасомных комплексов NLRP3 (белки NLRP3, ASC, CASP1) и NLRP1 (белки NLRP1 и CASP5), в псориатическом очаге и в непораженной коже больных и в коже здоровых доноров. Мы обнаружили достоверное повышение уровня экспрессии гена CASP1 в биоптатах пораженной кожи больных в 10,3 раз (р = 0,012) и в 8,3 раза в биоптатах непораженной кожи (р = 0,02). Статистически достоверного повышения экспрессии гена NLRP3 не показано (р = 0,102). Повышение экспрессии гена, кодирующего адаптерный белок ASC, в клетках псориатического очага оказалось статистически недостоверным (р = 0,182) (рис. 2).
Рис. 2. Экспрессия генов компонентов инфламмасомного комплекса NLRP3 в биоптатах пораженной и непораженной кожи больных псориазом и здоровой кожи доноров группы сравнения
Известно, что инфламмасомный комплекс NLRP1 также способен связывать и активировать молекулы про-каспазы-1, гиперэкспрессия которой нами была выявлена. Кроме того, показано, что NLRP1-инфламмасома рекрутирует молекулы прокаспазы-5, вызывая их активацию путем протеолитического расщепления без участия адаптерных белков ASC. Поэтому целесообразно было оценить экспрессию генов, кодирующих молекулы инфламмасомного комплекса NLRP1, в образцах пораженной и непораженной кожи при ПС и в образцах кожи здоровых доноров.
В клетках псориатического очага было выявлено статистически значимое увеличение экспрессии гена NLRP1 в 5 раз (р = 0,04811) в сравнении с соответствующим показателем для кожи здоровых доноров. Также достоверно увеличивалась экспрессия гена CASP5 в клетках пораженной кожи по отношению к группе сравнения в 200 раз (р = 0,000167). В клетках непораженной кожи больных ПС наблюдалось повышение экспрессии гена NLRP1 в 3,4 раза (р = 0,001243) и гиперэкспрессия гена CASP5 с повышением в 194 раза (р = 0,000169) относительно уровней экспрессии этих генов в здоровой коже (рис. 3).
Рис. 3. Экспрессия генов инфламмасомного комплекса NLRP1: NLRP1 и CASP5 в биоптатах пораженной и непораженной кожи больных псориазом и здоровой кожи доноров группы сравнения (график экспрессии CASP5 представлен в логарифмических координатах)
Сравнение уровней экспрессии генов компонентов инфламмасомных комплексов NLRP1 и NLRP3 в участках пораженной и непораженной кожи пациентов с ПС не выявило статистически значимых различий.
Активация инфламмасомных комплексов NLRP1 и NLRP3 обеспечивает формирование зрелых активных форм ИЛ-1Р и ИЛ-18, поэтому нами был исследованы уровень экспрессии генов этих цитокинов. В клетках очагов хронического псориатического воспаления пациентов основной группы были выявленные высокие показатели экспрессии генов IL1B и IL18. Так, нами продемонстрировано статистически достоверное повышение уровня экспрессии гена IL1B в 2,1 раза по сравнению с кожей здоровых доноров (р = 0,04). Уровень экспрессии второго изучаемого гена - IL18 - достоверно повышался в 8,4 раз по отношению к группе сравнения (р = 0,02). В непораженной коже больных ПС не выявлено значимого повышения экспрессии IL1B (р = 0,34), в то время как уровень экспрессии IL18 достоверно повышался в 5,9 раз по сравнению со значениями транскрипционной активности этого гена в биоптатах здоровой кожи доноров группы сравнения (р = 0,03) (рис. 4).
Рис. 4. Экспрессия генов IL1B и IL18 в биоптатах пораженной и непораженной кожи больных псориазом и в биоптатах здоровой кожи доноров группы сравнения
Обсуждение
Увеличение уровня экспрессии генов TLR7 и TLR9 в клетках кожи больных ПС подтверждает важность этих рецепторов в патогенезе заболевания. Лигандом для TLR9 является эндогенная ДНК, для TLR7 - эндогенная РНК. Известно, что в псориатическом очаге происходит постоянное разрушение клеток и высвобождение из них ауто-ДНК и ауто-РНК, которые в комплексе с кателицидином LL-37 проникают внутрь клеток путем экзоцитоза и выступают в роли аутоантигена при ПС [15, 16]. Постоянная активация распознающих рецепторов и передача сигнала по MyD88-зависимому сигнальному пути индуцируют выработку провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ИЛ-18, что ведет к прогрессированию воспалительного процесса и повреждению клеток в псориатическом очаге.
Активация эндосомальных TLRs является первым сигналом к индукции выработки провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ИЛ-18. Для индукции второго сигнала необходима сборка инфламмасомных комплексов, приводящая к активации каспаз-1 и -5, которые обеспечивают созревание молекул про-ИЛ-1β и про-ИЛ-18 [17]. В состав инфламмасомного комплекса входят сами распознающие NOD-подобные рецепторы, адаптерные белки ASC и молекулы прокаспаз-1 и -5. Высокие показатели экспрессии генов компонентов комплекса NLRP1 свидетельствуют о его возможной большей роли в развитии патогенеза ПС, чем компонентов комплекса NLRP3. Рецептор NLRP1 при активации связывает молекулы каспазы-1 и -5, достоверное увеличение экспрессии генов которых было продемонстрировано нами в биоптатах кожи больных ПС. Показанное многократное повышение экспрессии CASP5 и менее выраженное повышение экспрессии CASP1 в пораженной и непораженной коже позволяет предположить, что продукты этих генов могут выступать в роли потенциальных биомаркеров степени тяжести псориатического процесса.
Активация TLR7 и TLR9 индуцирует синтез молекул-предшественников провоспалительных цитокинов про-ИЛ-1β и про-ИЛ-18, а каспазы-1 и -5, процессируя их, обеспечивают переход в биологически активные формы. В связи с этим необходимо было оценить уровень экспрессии генов IL1B и IL18 в биоптатах кожи больных и доноров группы сравнения. Также была продемонстрирована прямая корреляционная зависимость между повышением экспрессии генов CASP5 и IL18 в пораженной коже у пациентов с тяжелым течением ПС (R = 0,606; р < 0,05). Полученные результаты согласуются с данными, полученными в ходе эксперимента
H. Rasmy и соавт. Исследователи показали увеличение экспрессии гена IL18 в псориатических бляшках, которая достоверно понижалась после лечения [18]. В исследовании I. Flistiak и соавт. было продемонстрировано повышение концентрации ИЛ-18 в плазме и выявлена корреляция между ее величиной и степенью тяжести псориатического процесса в соответствии с индексом PASI [19]. ИЛ-1β влияет на кератиноциты, индуцируя транскрипцию ряда генов, участвующих в воспалении, таких как TNFA, LL37, IFNG, а также запуская аберрантную пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов, которые характерны для псориатического процесса [20]. ИЛ-1β и ИЛ-18 также стимулируют секрецию фактора агрегации тромбоцитов, оксида азота и простагландинов, экспрессию ICAM и VCAM-1, увеличивая рекрутирование иммунных клеток в кожу. Кроме того, у пациентов с тяжелым течением ПС было показано увеличение уровня молекул адгезии ICAM-3, CD18 в сыворотке, что стимулирует воспалительные процессы в дерме [21]. К тому же ИЛ-1β, по-видимому, является ключевым цитокином в развитии кожных Th17-зависимых реакций при ПС [22].
Заключение
Проведенное нами сравнительное комплексное исследование экспрессии генов системы врожденного иммунитета при ПС представляет собой новый подход к изучению механизмов воспаления в псориатическом очаге. Полученные данные могут быть использованы для углубленного изучения специфических сигнальных путей активации инфламмасомных комплексов, а также влияния цитокинов на развитие псориатического процесса. Понимание роли клеточных и цитокиновых взаимодействий при ПС должно дать лучшее понимание механизма заболевания и помочь определить новые мишени для терапевтических вмешательств, а также предложить новые подходы в диагностике. Повышение экспрессии целевых генов как в здоровой, так и в пораженной коже пациентов с ПС говорит о системности изменений во врожденном иммунитете при псориатическом процессе. Увеличение экспрессии генов инфламмасомного комплекса NLRP1 и ИЛ-18 может быть предиктивным маркером для ранней диагностики ПС.
Вклад авторов
Концепция и дизайн исследования, руководство написанием статьи - Ганковская Л.В., сбор и обработка материала, отработка методики - Меркушова Е.Д., Хасанова Е.М.; статистическая обработка - Меркушова Е.Д.; написание текста, подготовка англоязычного варианта резюме - Меркушова Е.Д., Хасанова Е.М.; редактирование - Меркушова Е.Д., Ганковская Л.В.
Благодарность. Авторы выражают благодарность Центру высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России за возможность использования молекулярно-генетических технологий.
Литература
1. Молочков В.А., Бадокин В.В., Альбанова В.И., Волнухин В.А. Псориаз и псориатический артрит. Москва : Товарищество научных изданий КМК; Авторская академия, 2007: 298 с. ISBN: 978-5-87317-392-1.
2. Смольникова М.В. Генетические факторы в иммунопатогенезе псориаза и псориатического артрита. Медицинская иммунология. 2014; 16 (3): 211-20. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2014-3-211-220
3. Harden J.L., Krueger J.G., Bowcoc А. The immunogenetics of psoriasis: a comprehensive review. J. Autoimmun. 2015; 64: 66-73. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaut.2015.07.008
4. Tonel G., Conrad C. Interplay between keratinocytes and immune cells-recent insights into psoriasis pathogenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2009; 41 (5): 963-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biocel.2008.10.022
5. Gottlieb S.L., Gilleaudeau P., Johnson R., Estes L., Woodworth T.G., Gottlieb A.B., Krueger J.G. Response of psoriasis to a lymphocyte-selective toxin (DAB389IL-2) suggests a primary immune, but not keratinocyte, pathogenic basis. Nat. Med. 1995; 1 (5): 442-7. DOI: https://doi.org/10.1038/nm0595-442
6. Kim J., Krueger J.G. The immunopathogenesis of psoriasis. Dermatol. Clin. 2015; 33 (1): 13-23. DOI: https://doi.org/10.1016/j.det.2014.09.002
7. Lowes M.A., Suarez-Farinas M., Krueger J.G. Immunology of psoriasis. Annu. Rev. Immunol. 2014; 32: 227-55. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-032713-120225
8. Valdimarsson H., Bake B.S., Jonsdotdr I. Psoriasis: a disease of abnormal keratinocyte proliferation induced by T lymphocytes. Immunol. Today 1986; 7: 256-9. DOI: https://doi.org/10.1016/0167-5699(86)90005-8
9. Namazi M.R. Statins: novel additions to the dermatologic arsenal? Exp. Dermatol. 2004; 13 (6): 337-9. DOI: https://doi.org/10.1111/j.0906-6705.2004.00208.x
10. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мешкова Р.Я. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2014: 640 с. ISBN 978-5-9704-2241-0.
11. Krishnaswamy J.K., Chu T., Eisenbarth S.C. Beyond pattern recognition: NOD-like receptors in dendritic cells. Trends Immunol. 2013; 34 (5): 224-33. DOI: https://doi.org/10.1016/j.it.2012.12.003
12. Salskov-Iversen M.L., Johansen C., Kragballe K., Iversen L. Caspase-5 expression is upregulated in lesional psoriatic skin. J. Invest. Dermatol. 2011; 131: 670-76. DOI: https://doi.org/10.1038/jid.2010.370
13. Lai C.Y., Su Y.W., Lin K.I., Hsu L.C., Chuang T.H. Natural Modulators of endosomal Toll-like receptor-mediated psoriatic skin inflammation. J. Immunol. Res. 2017; 2017: 7807313. DOI: https://doi.org/10.1155/2017/7807313
14. Люцко В.В. Биопсия кожи в дерматологии. Современные проблемы здравоохранения и медицинской статистики. 2015; 4: 45-55.
15. Bianchi M.E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. J. Leukoc. Biol. 2007; 81 (1): 1-5. DOI: https://doi.org/10.1189/jlb.0306164
16. Zeiser R., Penack O., Holler E., Idzko M. Danger signals activating innate immunity in graft-versus-host disease. J. Mol. Med. (Berl.). 2011; 89: 833-45. DOI: https://doi.org/10.1007/s00109-011-0767-x
17. Меркушова Е.Д., Хасанова Е.М., Ганковская Л.В. Механизмы врожденного иммунитета в патогенезе псориаза: подходы к таргетной терапии. Медицинская иммунология. 2020; 22 (3): 449-58. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-MOI-1949
18. Rasmy H., Mikhael N., Ismail S. IL18 expression and the response to treatment in patients with psoriasis. Arch. Med. Sci. 2011; 7 (4): 713-9. DOI: https://doi.org/10.5114/aoms.2011.24144
19. Flisiak I., Klepacki A., Chodynicka B. Plasma and scales levels of interleukin 18 in comparison with other possible clinical and laboratory biomarkers of psoriasis activity. Biomarkers. 2006; 11 (2): 194-200.
20. Yano S., Banno T., Walsh R., Blumenberg M. Transcriptional responses of human epidermal keratinocytes to cytokine interleukin-1. J. Cell. Physiol. 2008; 214 (1): 1-13. DOI: https://doi.org/10.1002/jcp.21300
21. Караулов А.В., Кхедри Ф., Курников Г.Ю., Шумилова С.В., Касатова Е.С., Казацкая Ж.А., Копылова Г.Е., Кравченко Г.А., Евсегнеева И.В., Новиков В.В. Сывороточный уровень растворимых молекул адгезии и молекул гистосовместимости при псориазе. Иммунология. 2016; 37 (2): 84-9.
22. Kryczek I., Bruce A., Gudjonsson J., Johnston A., Aphale A., Vatan L. Induction of IL-17+ T cell trafficking and development by IFN-gamma: mechanism and pathological relevance in psoriasis. J. Immunol. 2008; 181: 4733-41. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.181.7.4733