Динамика специфического гуморального ответа у пациентов, перенесших COVID-19

• Закурская Вита Яковлевна
• Сизякина Людмила Петровна
• Харитонова Мария Владимировна
• Шлык Сергей Владимирович

Резюме

Введение. Пандемия, вызванная вирусом SARS-CoV-2, является важной медико-социальной проблемой. Пока не выяснены стойкость выработанного гуморального иммунитета против вируса SARS-CoV-2 и средний срок сохранения титра специфических антител. Необходимость выявления гуморальных механизмов иммунной защиты у переболевших COVID-19 определило цель данного исследования.

Цель - оценить динамику содержания специфических антител к различным антигенам вируса SARS-CoV-2 и субпопуляций В-лимфоцитов на протяжении года у лиц, перенесших COVID-19.

Материал и методы. В исследование были включены 90 пациентов, перенесших COVID-19 в различных формах, впоследствии разделенных на 2 группы: лица с бессимптомным и легким течением (57 пациентов) и со среднетяжелым или тяжелым течением заболевания (33 пациента). Динамику концентрации специфических антител к вирусу SARS-CoV-2 оценивали с помощью иммуноферментного анализа каждые 3 мес в течение года. Содержание общего пула В-лимфоцитов и их субпопуляций (наивные В-лимфоциты, В-клетки памяти, регуляторные В-лимфоциты) оценивали методом проточной цитофлуориметрии.

Результаты. При оценке динамики IgG к S-белку вируса SARS-CoV-2 отмечено их сохранение к 12-му месяцу с момента выздоровления. У пациентов с тяжелыми и среднетяжелыми формами COVID-19 данные показатели значимо более высокие. Более тяжелые формы COVID-19 сопровождаются значимо большим уровнем В-клеток памяти на протяжении всего периода наблюдения.

Заключение. Среднетяжелые и тяжелые формы COVID-19 индуцируют более стойкий постинфекционный гуморальный иммунитет, обеспечиваемый возрастанием количества В-клеток памяти в сравнении с более легкими формами.

Ключевые слова:коронавирусная инфекция; COVID-19; антитела; гуморальный иммунитет; В-клетки памяти

Введение

Продолжающаяся пандемия, вызванная вирусом SARS-CoV-2, является важной медико-социальной проблемой современности. Эффективное лечение пациентов с новой коронавирусной инфекцией во многом остается дискуссионным, в результате этого терапевтические стратегии регулярно сменяют друг друга. Состояние иммунной системы при инфицировании SARS-CoV-2 - один из решающих факторов, определяющих результаты лечения пациентов. Расшифровка механизмов формирования противовирусного иммунитета, определение его роли в развитии инфекционного процесса позволит контролировать течение пандемии. Известно, что инфицирование SARS-CoV-2 приводит к сероконверсии и выработке антител против вируса, которые могут подавлять его репликацию посредством нейтрализации. В геноме вируса SARS-CoV-2 кодируются 4 основных структурных белка: поверхностный гликопротеин шипа (S), белок мембраны (M), белок оболочки (E) и белок нуклеокапсида (N) [1]. Первичной мишенью иммунного ответа во время коронавирусной инфекции является белок S (Spike) [2-5]. Белок S отвечает за взаимодействие SARS-CoV-2 с клетками хозяина посредством связывания с рецептором ACE2 [6-8]. Он состоит из 2 субъединиц: S1 и S2. Субъединица S1 содержит рецептор-связывающий домен (RBD) [9]. N-белок демонстрирует различные функции, необходимые для функционирования и размножения вируса, являясь еще одним важным компонентом после белков шипа [10]. Известно, что успех постинфекционного иммунитета во многом зависит от генерации мощного и длительного гуморального ответа за счет индукции В-клеток памяти и долгоживущих плазматических клеток, которые обеспечивают непрерывную циркуляцию высокоаффинных антител. В-клетки иммунной памяти, генерируемые после выздоровления, играют важную роль в защите человека при повторном контакте с вирусом [11, 12].

COVID-19 может протекать с различной степенью тяжести - от бессимптомного течения до опасных для жизни состояний. Взаимосвязь между степенью тяжести заболевания и гуморальным иммунным ответом изучена недостаточно. Кроме того, понимание кинетики и продолжительности гуморального ответа важно для определения того, как лучше всего использовать тестирование на антитела в клинической практике, а также как интерпретировать результаты серологических исследований.

Цель исследования - изучить динамику содержания специфических антител к различным антигенам вируса SARS-CoV-2 и субпопуляций В-лимфоцитов на протяжении 12 мес у лиц, перенесших COVID-19.

Материал и методы

Участники исследования. В исследование были включены лица, перенесшие новую коронавирусную инфекцию. Факт инфицирования подтверждался положительным результатом ПЦР-теста в острый период заболевания. Клинические формы перенесенного заболевания варьировали от бессимптомных до тяжелых. Клиническое исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации "Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека" с поправками 2000 г., WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects (2013), Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Минздрава России № 266 от 19.06.2003. Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Всего в исследовании принимали участие 90 человек, 42 мужчины (средний возраст 42 ± 8,6 года) и 48 женщин (средний возраст 45 ± 10,8 года). Забор венозной крови для исследования проводился 6-кратно с интервалами в 3 мес, начиная с момента выздоровления (1-й месяц) и завершаясь через год (12-й месяц). Группу сравнения составили здоровые лица, сопоставимые по возрасту и полу (30 человек).

Лабораторные исследования. У пациентов количественно, методом иммуноферментного анализа, определяли антитела класса IgG к N-белку SARS-CoV-2 в сыворотке крови с помощью тест-системы (набор реагентов для иммуноферментного количественного определения N-CoV-2-IgG PS, серия 001), разработанной и произведенной ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (г. Санкт-Петербург, регистрационное удостоверение № РЗН 2021/14085). Концентрацию антител выражали в условных единицах (у.е./мл) и оценивали следующим образом: образцы, у которых рассчитанная концентрация была < 100 у.е./мл (предел количественного определения), считаются отрицательными, > 100 у.е./мл - оцениваются как положительные. При этом концентрация > 3000 у.е./мл оценивается как очень высокий уровень наличия специфических IgG-антител, концентрация в диапазоне 3000-1501 у.е./мл - как высокий уровень, 1500-751 у.е./мл - как средний уровень, 750-187 у.е./мл - как низкий уровень, 186-100 у.е./мл - как очень низкий уровень. Содержание в сыворотке крови специфических IgG к S-белку и IgM к нуклеокапсиду (N-белок) и к RBD-участку S-белка определяли полуколичественно с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем АО "Вектор-Бест" (Россия). Результаты исследования образцов выражали в виде коэффициента позитивности (КП) по формуле: КП = ОПобр./ОПкрит. Результат анализа считался положительным, если КПобр. ≥ 1,1; отрицательным - при КПобр. < 0,8; пограничным - при 0,8 ≤ КПобр. < 1,1.

Иммунофенотипирование проводили с помощью проточной цитофлуориметрии на приборе Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). С помощью соответствующих моноклональных антител (Beckman Coulter, США) были идентифицированы наивные В-лимфоциты (СD19⁺CD27^-), В-клетки памяти c переключенным изотипом (CD19⁺CD27⁺IgD^-IgM^-), регуляторные В-лимфоциты (CD19⁺CD5⁺CD1d⁺) и общий пул В-лимфоцитов (CD19⁺СD3^-) в исследуемой группе и в группе сравнения.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 10 (StatSoft Inc., США). Описательную статистику количественных признаков представляли в виде центральной тенденции медианы и межквартильного размаха (25-й и 75-й процентили), представлено в тексте как Ме [LQ; UQ]. Медианы в группах сравнивали с использованием критерия Вилкоксона для связанных выборок. Непараметрический дисперсионный анализ (ANOVA) динамики специфических антител проводили с применением теста Фридмана. Различия признавались статистически значимыми на уровне р < 0,05.

Результаты

В сыворотке обследуемых отмечается прогрессирующее снижение титра специфических IgM и IgG к S-белку SARS-CoV-2. Содержание IgG к N-белку на протяжении всего периода исследования значительно варьировало, зависимости между уровнем данных антител и сроком со времени выздоровления не отмечено (табл. 1).

Таблица 1. Динамика содержания специфических антител у лиц, перенесших COVID-19

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: * - статистическая значимость различий показателей (p < 0,05) рассчитана с применением теста Фридмана; КП - коэффициент позитивности.

Учитывая, что обследуемые лица переболели COVID-19 разной степени тяжести, все пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от степени тяжести перенесенного заболевания. В 1-ю группу вошли 57 пациентов с легкими или бессимптомными формами заболевания. В 2-ю группу - 33 пациента со среднетяжелыми или тяжелыми формами заболевания. Уровни специфических антител в 1-й группе прогрессивно снижались к 12-му месяцу после выздоровления (табл. 2).

Таблица 2. Динамика содержания специфических антител у лиц, перенесших COVID-19 в легкой или в бессимптомной форме

У пациентов во 2-й группе содержание специфических IgM прогрессивно снижалось в течение года, в то время как уровень IgG к S-белку сохранялся на высоком уровне даже к 12-му месяцу после выздоровления (табл. 3).

Таблица 3. Динамика содержания специфических антител у лиц, перенесших COVID-19 в среднетяжелой или в тяжелой форме

При сравнении динамики содержания в сыворотке IgM в группах с легкими или бессимптомными формами и со среднетяжелой или тяжелой формой COVID-19 отмечена общая тенденция к его снижению, с полным исчезновением антител к 9-му месяцу после выздоровления. Однако у пациентов с тяжелыми и среднетяжелыми формами заболевания данные показатели статистически достоверно более высокие.

При сравнении динамики антител IgG к S-белку в обследуемых группах также отмечена общая тенденция к снижению его содержания. Однако у пациентов с тяжелой или среднетяжелой формой заболевания данные показатели статистически значимо более высокие, а их динамическое снижение замедлено.

С учетом выявленных особенностей динамики специфических антител в зависимости от формы заболевания представляло интерес проанализировать различные субпопуляции В-лимфоцитов в динамике формирования постинфекционного иммунитета, а также длительность сохранения выявленных изменений.

В содержании В-лимфоцитов у переболевших как в легкой форме, так и в тяжелой, вне зависимости от срока давности (< 6 мес и > 6 мес), значимых различий не обнаружено. Однако при исследовании субпопуляционного состава В-лимфоцитов было выявлено, что содержание наивных В-клеток у всех переболевших вне зависимости от варианта течения и длительности существенно не отличалось. Наиболее интересные результаты были получены в отношении количества в крови В-клеток памяти. Если у лиц, переболевших в легкой форме, существенной динамики не обнаруживалось, у переболевших тяжелой формой COVID-19 выявлено существенное увеличение количества В-клеток памяти по сравнению с пациентами, перенесшими легкий вариант течения COVID-19. Следует также подчеркнуть, что с течением времени у пациентов со среднетяжелой и тяжелой формой COVID-19 отмечена тенденция к снижению количества В-клеток памяти, подтвержденная данными статистики, в относительных и в абсолютных значениях. Еще одним интересным моментом является динамика Breg-клеток, обладающих супрессивным эффектом, количество которых статистически значимо выше у пациентов, перенесших COVID-19 в среднетяжелой и в тяжелой форме (табл. 4).

Таблица 4. Динамика иммунологических показателей у пациентов, перенесших COVID-19, в зависимости от степени тяжести заболевания и сроков со времени выздоровления

Примечание. * - статистическая значимость различий показателей между группами до 6 мес (p < 0,05), рассчитанная с учетом U-критерия Вилкоксона; в таблице средние значения представлены в виде Ме [LQ; UQ]; ** - статистическая значимость различий показателей между группами > 6 мес (p < 0,05), рассчитанная с учетом U-критерия Вилкоксона; в таблице средние значения представлены в виде Ме [LQ; UQ].

Обсуждение

Полученные результаты демонстрируют, что на протяжении 12 мес достоверно сохраняются IgG, специфические к S-белку SARS-CoV-2, что опровергает ранее полученные данные о среднем сроке сохранения специфических антител до 6 мес со времени выздоровления [13, 14]. Максимальное содержание специфических антител достигается уже к 1-му месяцу со времени выздоровления, постепенно снижаясь к году наблюдения. При этом степень тяжести перенесенной инфекции напрямую влияет на содержание антител и скорость ослабления специфического гуморального ответа. Также интересен факт длительного сохранения IgM (до 6 мес) и их более высокий уровень у лиц со среднетяжелыми и тяжелыми формами COVID-19. Это позволяет предположить, что более тяжелые случаи могут быть связаны с формированием более сильного гуморального иммунного ответа. Вероятно, подобные изменения связаны с нарушением процессов переключения изотипов антител в В-лимфоцитах, обусловленных особенностями взаимодействия между иммунной системой и вирусом. Полученные данные вызывают вопросы о защитной способности специфических иммуноглобулинов и могут свидетельствовать об их возможном участии в патогенезе COVID-19. Возможно, антитела могут не только подавлять репликацию вируса посредством нейтрализации, но и участвовать в процессах антителозависимого усиления инфекции [15-17]. Данный вопрос требует дальнейшего изучения.

Учитывая, что синтез специфических антител осуществляется В-лимфоцитами, представляло интерес изучить характер изменений количества данных клеток в крови у лиц, переболевших COVID-19.

При анализе абсолютного и относительного количества В-клеток мы не обнаружили значительных различий у пациентов с COVID-19 независимо от времени после заболевания и от формы заболевания. Однако при анализе субпопуляций В-лимфоцитов были выявлены различия в количестве В клеток памяти. Эти клетки являются источником долгоживущих плазматических клеток, обеспечивающих противоинфекционную защиту [18]. Сейчас появляются доказательства того, что разные субпопуляции В-клеток памяти могут выполнять различные функции, причем некоторые из них при реактивации продуцируют антитела класса IgM, а не IgG [19, 20]. Данный факт может объяснить длительное сохранение специфических IgM у лиц со среднетяжелыми и с тяжелыми формами COVID-19, которое наблюдалось в нашей работе и которое обусловлено статистически достоверным увеличением содержания в крови CD19⁺CD27⁺-лимфоцитов у этих пациентов.

Заключение

Таким образом, полученные результаты демонстрируют ассоциацию силы и стойкости постинфекционного гуморального иммунитета со степенью тяжести СOVID-19. Это выражается в более высоком уровне специфических иммуноглобулинов, большей длительности их сохранения, обусловленных высоким содержанием В-клеток памяти у лиц, перенесших COVID-19 в среднетяжелых и тяжелых формах.

Литература

1. Buchholz U.J., Bukreyev A., Yang L., Lamirande E.W., Murphy B.R., Subbarao K., Collins P.L. Contributions of the structural proteins of severe acute respiratory syndrome coronavirus to protective immunity. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004. 101: 9804-9. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0403492101

2. Deming D., Sheahan T., Heise M., Yount B., Davis N., Sims A., Suthar M. et al. Vaccine efficacy in senescent mice challenged with recombinant SARS-CoV bearing epidemic and zoonotic spike variants. PLoS Med. 2006. 3: e525. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0030525

3. Suthar M.S., Zimmerman M., Kauffman R., Mantus G., Linderman S., Vanderheiden A., Nyhoff L. et al. Rapid generation of neutralizing antibody responses in COVID-19 patients. Cell Rep. Med. 2020; 1 (3): 100040. DOI: https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2020.100040

4. Robbiani D.F., Gaebler C., Muecksch F. et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 2020; 584 (7821): 437-42. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2456-9

5. Гудима Г.О., Хаитов Р.М., Кудлай Д.А. Хаитов М.Р. Молекулярно-иммунологические аспекты диагностики, профилактики и лечения коронавирусной инфекции. Иммунология. 2021; 42 (3): 198-210. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-198-210

6. Bosch B.J., van der Zee R., de Haan C.A., Rottier P.J. The coronavirus spike protein is a class I virus fusion protein: structural and functional characterization of the fusion core complex J. Virol. 2003; 77 (16): 8801-11. DOI: https://doi.org/10.1128/jvi.77.16.8801-8811.2003

7. Hoffmann M., Kleine-Weber H., Schroeder S., Kruger N., Herrler T., Erichsen S., Schiergens T.S. et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell 2020. 181: 271-80.e8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.052

8. Wang Q., Zhang Y., Wu L., Niu S., Song C., Zhang Z., Lu G. et al. Structural and functional basis of SARS-CoV-2 entry by using human ACE2. Cell 2020. 181: 894-904.e9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.045

9. Walls A.C., Park Y.J., Tortorici M.A., Wall A., McGuire A.T., Veesler D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 2020. 181: 281-92.e6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.058

10. Satarker S., Nampoothiri M. Structural proteins in severe acute respiratory syndrome coronavirus-2. Arch. Med. Res. 2020; 51 (6): 482-91. DOI: https://doi.org/10.1016/j.arcmed.2020.05.012

11. Petrov R.V., Khaitov R.M. B-cell suppression of antibody response to sheep red blood cells in mice of high- and low-responding genotypes. Cell. Immunol. 1977; 28 (2): 298-306. DOI: https://doi.org/10.1016/0008-8749(77)90113-7

12. Petrov R.M., Khaitov R.M., Pinegin B.V. Supressor B lymphocytes (Soviet Medical Reviews Supplement Series, Section B) (Vol. 1). Switzerland: Harwood Academic Publishers, 1988: 208 p. ISBN 9783718648009.

13. Сметанина С.В., Исаев А.Н., Исаева Ю.О. и др. Изменение уровня антител класса IgG к коронавирусу SARS-CoV-2 (COVID-19) у населения регионов Российской Федерации и в динамике у реконвалесцентов. Consilium Medicum. 2020; 22 (11): 47-50. DOI: https://doi.org/10.26442/20751753.2020.11.200417

14. Новикова Е.А., Петрова А.Г., Москалева Е.В., Ваняркина А.С., Рычкова Л.В. Ретроспектива международных серологических исследований по формированию и динамике гуморального иммунного ответа к SARS-CoV-2: от 2020 к 2021. Acta Biomedica Scientifica. 2021; 6 (2): 47-57. DOI: https://doi.org/10.29413/ABS.2021-6.2.5

15. Peiris J.S.M., Chu C.M., Cheng V.C.C., Chan K.S., Hung I.F.N., Poon L.L.M., Law K.I., Tang B.S.F., Hon T.Y.W., Chan C.S. et al. Clinical progression and viral load in a community outbreak of coronavirus-associated SARS pneumonia: a prospective study. Lancet. 2003; 361 (9371): 1767-72. DOI: https://doi.org/10.1016/s0140-6736(03)13412-5

16. Glass D.R., Tsai A.G., Oliveria J.P., Hartmann F.J., Kimmey S.C., Calderon A.A. et al. An integrated multi-omic single-cell atlas of human B cell identity. Immunity. 2020; 53 (1): 217-32.e5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.06.013

17. Chen G., Wu D., Guo W., Cao Y., Huang D., Wang H. et al. Clinical and immunological features of severe and moderate coronavirus disease 2019. J. Clin. Invest. 2020; 130 (5): 2620-9. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI137244

18. Akkaya M., Kwak K., Pierce S.K. B cell memory: building two walls of protection against pathogens. Nat. Rev. Immunol. 2020; 20 (4): 229-38. DOI: https://doi.org/10.1038/s41577-019-0244-2

19. Tomayko M.M., Allman D. What B cell memories are made of. Curr. Opin. Immunol. 2019; 57: 58-64. DOI: https://doi.org/10.1016/j.coi.2019.01.003

20. Петров Р.В., Хаитов Р.М. Лимфоциты-супрессоры B-ряда - B-супрессоры. Успехи современной биологии. 1981; 91 (1): 8-28. PMID: 6455876.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)