서 언
재료 및 방법
식물재료 및 캘러스 유도
재분화능 체세포배 세포의 유도 및 재분화
RT - PCR
항원 항체 반응
결과 및 고찰
미숙배주로부터 캘러스 세포 유도 및 증식
체세포배 형성능 세포의 선발 및 식물체 재분화
RT – PCR를 이용한 바이러스 감염여부 검증
항원 항체 반응을 이용한 CTV 감염 여부 검증
서 언
제주도 감귤에 발생하는 주요 바이러스로는 접목이상병(CTLV, Citrus tatter leaf virus), 온주위축병(SDV, Satuma dwarf virus), 갈색줄무늬오갈병(CTV, Citrus tristeza virus) 3종이 알려져 있다(Kim et al., 1999). 이 3종의 바이러스는 감귤품종에 따라서 병증 이 다르게 나타나며(Lee, 2004; Miyakawa, 1977) 감귤에 발행하는 주요 바이러스 중 진딧물 매개충으로 인해 감염되는 CTV(Roy et al., 2010)는 제주도 감귤품종에 널리 감염되어 있다(Kim et al., 1999). 또한 이 감귤 바이러스에 감염된 품종들은 수세약화, 수 량감소, 과실의 품질저하 등 피해(Naz et al., 2007)를 가져오기 때문에 주요 품종의 무병주 보급을 위한 체계적 식물체 확보 방 법이 필요하다.
감귤에서 무병주 식물체를 획득하기 위한 방법으로는 열처리 방법(Grant, 1957), 주심배 배양(Singh et al., 2006), 배주배양 방 법(Feng et al., 1990; Navarro, 1984; Singh et al., 2005) 그리고 최근에는 기내 경정접목(Naz et al., 2007; Roistacher et al., 1976; Sharma et al., 2007; Singh et al., 2008)이 사용되고 있다. 열처리 방법은 식물의 생산량 감소와 성장발육에 영향을 주는 감귤류 엑소콜티 스 바이로이드(CEVd, Citrus exocortis viroid) 그리고 형태학적으로 비정상적인 감귤을 만드는 감귤 스터번병(CSD, Citrus stubborn disease)을 제거하는데 어렵다(Naz et al., 2007). 반면에 바이러스가 전파되는 것보다 더 빨리 세포분열이 일어나 바이 러스 프리일 가능성이 높은(Naz et al., 2007) 생장점 부위를 이용한 기내 경정접목 방법은 열처리 방법으로 제거하기 어려운 병 원균을 모두 제거할 수 있기 때문에 감귤 무병주 획득 방법으로 사용되고 있다(Naz et al., 2007; Sharma et al., 2007; Singh et al., 2008). 그러나, 이 방법은 기내에서 작업하기가 어렵고 많은 무병주 식물체를 얻기는 쉽지 않다 .
따라서 이러한 문제점들을 해결하기 위한 방법으로 수정되지 않은 배주를 배양하는 방법이 사용되기도 한다. 수정되지 않 은 배주는 바이러스에 감염되어 있지 않기 때문에 이를 배양하여 무병주인 감귤 식물체를 만드는데 이용되고 있다(Navarro, 1984; Shingh et al., 2005). 본 연구는 주요 감귤 품종들의 무병주 보급을 위한 체계적인 식물체 확보를 위하여 CTV에 감염된 온 주밀감 품종과 재래귤 품종의 배주로부터 캘러스 세포를 유도 하고, 선발된 체세포배 형성능 캘러스 세포로부터 재분화 식물 체를 확보하였으며, 무병주임을 확인하기 위하여 RT - PCR과 항혈청 방법을 수행하였다.
재료 및 방법
식물재료 및 캘러스 유도
제주도 재래감귤 3품종[동정귤(Citrus erythrosa Hort. et Tanaka), 청귤(Citrus nippokoreana Tanaka), 지각(Citrus aurantium L.)] 그리고 온주밀감 2품종[궁천조생(Citrus unshiu Miywagawa wase), 하례조생(Citrus unshiu Marcow)]의 꽃은 5월에서 6 월경 감귤시험장에서 채집하였다. 꽃 내부 자방 내의 수정되지 않은 배주는 현미경하에서 나출하여 실험에 사용하였다. 배지 조성에 따른 수정되지 않은 배주로부터 체세포배의 형성과 캘러스 유도 효과를 조사하기 위하여, 나출한 배주는 MS1[MS(Murashige and Skoog, 1962) 기본배지에 malt extract 500mg·L-1, sucrose 50g·L-1 그리고 agar 8g·L-1가 첨가된 배 지], MS2(MS 기본배지에 malt extract 500mg·L-1, sucrose 50g·L-1, kinetin 1.0mg·L-1 그리고 agar 8g·L-1가 첨가된 배지), MS3(MS 기본배지에 malt extract 500mg·L-1, sucrose 50g·L-1, N6-benzyladenine(BA) 3.0mg·L-1 그리고 agar 8g·L-1 가 첨가 된 배지), EME[MT(Murashige and Tucker, 1969) 기본배지에 malt extract 500mg·L-1 , sucrose 50g·L-1 그리고 agar 8g·L-1 가 첨가된 배지] (Grosser and Gmitter, 1990) 및 1 / 2 EME(1 / 2 MT macronutrients, 1 / 2 BH3 macronutrients, malt extract 500mg·L-1, glutamine 1.55g·L-1 그리고 agar 8g·L-1 가 첨가된 배지)(Grosser and Gmitter, 1990) 총 5가지 배지조성에 각각 50개씩 치상하 여 광이 완전히 차단되지 않은 반암 조건하에서4 - 6주간 배양하였다.
재분화능 체세포배 세포의 유도 및 재분화
캘러스 세포로부터 재분화능 체세포배를 유도하기 위하여, 수정되지 않은 배주로부터 유도된 캘러스 세포는 MT 기본배지 에 malt extract 500mg·L-1, Lactose 70g·L-1 그리고 agar 16g·L-1 가 첨가된 체세포배 유도 배지(Jin et al., 2007)에 치상하여 4 - 6주간 명배양 하였다. 유도된 재분화능 체세포배로부터 식물체를 재분화 시키기 위하여, 재래감귤의 체세포배는 malt extract 500mg·L-1, sucrose 50g·L-1 그리고 agar 8g·L-1가 첨가된 MS 기본배지에 에 옮기고 온주밀감 품종들의 체세포배는 sorbitol 1.0M, galactose 1.0M, GA3 1.0mg·L-1 그리고 gelrite 3g·L-1가 첨가된 MT 기본배지에 약 10주간 명배양 하였다. 기내배양에 서 신초 와 뿌리가 형성된 감귤류들은 121°C에서 15분간 멸균 처리한 상토에 옮겨 심었다. 반면 뿌리가 형성되지 않는 감귤류 들은 Jin et al.(2007)의 방법에 따라서 탱자(Poncirus trifoliate Raf.) 대목에 접목 하였다. 모든 식물체들은 25 ± 2°C, 45μmol·m-2·sec-1, 16시간 광주기 조건하에서 순화시켰다.
RT - PCR
바이러스 감염 여부를 확인 하기 위해 국립원예특작과학원 감귤시험장포장 노지내의 제주도 재래감귤로 3품종(동정귤, 청 귤, 지각) 그리고 온주밀감 2품종(궁천조생, 하례조생)과 배주배양을 통하여 확보한 기내배양 식물체들의 잎을 RT - PCR 검정 을 위한 시료로 사용하였다. RT - PCR를 위한 감귤류의 Total RNA는 FastPureTM RNA Kit(Takara, Bio Inc., Japan)를 사용하 여 추출하였다. cDNA는 TopscriptTM cDNA Synthesis kit(Enzynomics, Co., Daejeon, Korea)를 사용하여 합성하였다. RT - PCR검정을 위한 CTV 감염 여부 검증에 사용한 프라이머 set는 감귤 연구소 현재욱 박사님으로부터 제공받은 CTV - PoF / R, CTV - 32 / 52 그리고 CTV - CO - 1F / R를 사용하였고, cDNA 농도여부는 actin 유전자를 reference gene으로 한 primer(Actin F / R)을 사용하여 확인하였다(Table 1). PCR 반응액은 AccuPower PCR Premix(Bioneer, Corp., Daejeon, Korea)[250μM dNTP, 1.5mM MgCl2, 1.0unit Taq DNA polymerase, 10mM Tris - HCl(pH 9.0), 40mM KCl]에 cDNA 25 - 50ng 그리고 0.5μM의 프라이머를 첨가하여 20μl로 조정하여 사용하였다. PCR 반응은 Takara PCR Thermal cycle(Takara, Bio Inc., Japan) 에서 35cycle을 실시하였으며, denaturation은 94°C에서 30초, annealing은 55°C에서 30초, 그리고 extension을 72°C에서 30 초간 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물은 1.2% agarose gel에서100V로 30분 동안 전기영동하여 나타나는 밴드로 확인하였다.
항원 항체 반응
감귤 품종들의 CTV 감염여부는 CTV immuneStrip test(Agdia, Inc., EIkhart, IN., USA)를 구매하여 항원 항체 반응으로 검 정하였다. CTV 감염 여부를 확인하기 위해 국립원예특작과학원 감귤시험장포장 노지내의 제주도 재래감귤로3품 종(동정귤, 청귤, 지각) 그리고 온주밀감 2품종(궁천조생, 하례조생)과 배주배양을 통하여 확보한 기내배양 식물체들 5품종(동정귤, 청귤, 지각, 궁천조생, 하례조생)의 잎을 사용하였다.
결과 및 고찰
미숙배주로부터 캘러스 세포 유도 및 증식
배지조성과 감귤의 유전자형[제주도 재래감귤 3품종(동정귤, 청귤, 지각) 그리고 온주밀감 2품종(궁천조생, 하례조생)]에 따 라서 감귤의 꽃 내부 자방 안쪽에 있는 수정되지 않은 배주로부터 체세포배 와 그 주변에서 유도된 하얀 솜 같은 캘러스 세포의 유도효과를 배양 4주 후 조사한 결과 Table 2에서 보는 것처럼 비록 재래감귤 3품종 중 청귤은 1 / 2 EME배지, 지각은 MS1 배 지조성에서 미숙 배주로부터 체세포배 형성개수가 각각 30, 18개로 다른 배지조성에 비하여 높은 효과를 얻었으나, 체세포배 로부터 캘러스 유도 효과는 각각 6, 1개로 MS2 배지조성에 비하여 낮게 나타났다. MS2 배지조성에서 체세포배를 형성한 재 래감귤(동정귤, 청귤, 지각)의 미숙배주 개수는 각각 10, 21, 13개 이며, 온주밀감(궁천조생, 하례조생)은 각각 5, 7개를 얻었다. 그리고, 캘러스 세포를 유도하는 재래감귤의 체세포 배 개수는 각각 2, 4, 2개 그리고 온주밀감은 각각 4, 5개로써 체세포배 주 변으로부터 얻었다(Table 2). 감귤은 유전자형과 배지조성에 따라서 체세포배 형성과 캘러스 세포 유도에 영향을 받는다고 하 였다(El-sawy et al., 2005; Tomaz MI et al., 2001). 본 연구에서도 유전자형과 배지조성에 따라서 체세포배 형성 효과에 대한 차이점을 보였으나, 체세포배 주변으로부터 캘러스 세포의 유도 효과는 다른 배지 조성에 비하여 MS2 배지조건에서 동일하 게 높게 관찰 되었다. 또한, Fig. 1에서 보는 것처럼 감귤의 유전자형은 먼저 배주로부터 녹색의 체세포배가 형성되고 그 주변 에서 하얀 솜 같은 형태의 캘러스 세포가 유도 되는 것을 배양 4주 후 관찰 할 수 있는데, 이와 같은 결과는 온주밀감 성숙과실 내의 미발달 된 배주로부터 캘러스 세포를 얻은 연구 결과(Jin et al., 2007)와 Eureka lemon[Citrus limon (L.) Burm f. (‘Eureka’)] 의 미성숙 과실 내 종자로부터 캘러스 세포를 얻은 연구결과(Gholami et al., 2013)와 유사하였다. 일반적으로 감귤품종들의 체 세포배 형성능 캘러스 세포의 유도는 배주, 화분, juice vesicles, stigma 그리고 style조직으로부터 얻어지는데(Carmi, 2005), 본 연구에서도 마찬가지로 체세포배 형성능 캘러스 세포는 배주 조직으로부터 얻었다.
Fig. 1.
Induction of callus cells from unfertilized immature ovules from open flowers in Citrus spp. Vertical arrow indicates callus cells surrounding the somatic embryo induced from ovules.
유도된 세포들은 MT 기본배지에 malt extract 500mg·L-1, sucrose 50g·L-1, adenine 34mg·L-1, GA3 1.0mg·L-1 그리고 gelrite 2g·L-1가 첨가된 배지로 옮겨 암조건 하에서 2주 간격으로 12주간 계대배양 함으로써 캘러스 세포로만 증식 및 유지 시킬 수 있 었다. 결과적으로, 수정되지 않은 배주로부터 캘러스 세포를 유도하고 증식시키는데 소요된 시간은 총16 주 걸렸다.
체세포배 형성능 세포의 선발 및 식물체 재분화
캘러스 세포로부터 체세포배 형성능 세포만을 선발하기 위하여, 증식된 캘러스 세포들은 MT 기본배지에 malt extract 500mg·L-1, lactose 70g·L-1 그리고 agar 16g·L-1가 첨가된 고체배지에 배양하였고, 그린 색깔의 체세포배를 형성하는 세포는 배양 6주 후 얻었다(Fig. 2). 캘러스 세포로부터 체세포배의 형성은 세포의 스트레스를 주는 물질로 탄수화물의 종류와 농도 그 리고 agar 농도가 주요한 요인으로 작용하는데(Carmi, 2005; Gholami et al., 2013; Jin et al., 2007), 본 연구에서는 세포의 스 트레스 작용으로써 lactose 70g·L-1와 건조 스트레스 작용으로써 agar 16g·L-1을 이용하여 캘러스 세포로부터 체세포배를 얻 었다. Jin et al. (2007)에 따르면 온주밀감의 캘러스 세포로부터 체세포배를 얻는데 malt extract 500mg·L-1, Lactose 70g·L-1 그 리고 agar 14g·L-1가 첨가된 MT 기본배지가 효과적이라고 하였으나, 본 연구에서는 체세포배 형성에 있어서 무기물 조성(MS, MT 기본배지)에 따른 차이점은 없었고, 단지 agar 농도를 높여 주었을 때 배 형성시기가 약 1주 정도 단축되었다(자료 미제시). 비록, 주변 세포들이 건조되면서 갈변되어 죽어버리는 문제점은 있지만 빠른 시일 내에 계대배양을 해줌으로써 이와 같은 문 제점은 해결 할 수 있었다. 위 결과로 세포의 스트레스를 주는 물질로써 고농도 agar의 사용은 체세포배 형성 시기를 단축하는 데 주요하게 작용한다는 것을 알 수 있었다. 또한, 체세포배 형성능 캘러스 세포만을 얻기 위하여, 체세포배 형성능 캘러스 세 포는 체세포배 형성 주변 캘러스 세포들을 MT 기본배지에 malt extract 500mg·L-1, sucrose 50g·L-1 그리고 agar 8g·L-1가 첨가된 고체배지로 옮겨 4주 간격으로 동일한 배지상에 계대배양하여 얻었다.
Fig. 2.
Induction of somatic embryo from callus cells inC itrus spp.: ‘Dongjeongkyool’ (A); ‘Cheongkyool’ (B); ‘Jikak’(C); ‘Myiwagawa Wase.’ (D); ‘Haryejosaeng’ (E).
체세포배로부터 유식물체의 유도함에 있어서 재래감귤 3품종(동정귤, 청귤, 지각)은 MS 기본배지에 malt extract 500mg·L-1, sucrose 50g·L-1 그리고 agar 8g·L-1가 첨가된 배지에 옮겨 10주간 명배양 하여 얻어진 정상적인 식물체는 순화과정을 통하여 약 60% 이상의 유식물체를 얻었다(Fig. 3). 이와 같은 결과는 네블오렌지 품종의 체세포배로부터 유식물체를 얻은 연구결과 (Carmi et al., 1998)와 유사하였다.
Fig. 3.
Induction of normal plants from somatic embryos of Citrus cultivars native to Jeju: Induction of plants from ‘Dongjeongykool’ somatic embryos and acclimatization (A); induction of plants from ‘Cheongkyool’ somatic embryos and acclimatization (B); induction of plants from ‘Jikak’ somatic embryos and acclimatization (C).
반면, 온주밀감 2품종(궁천조생, 하례조생)의 체세포배로부터 식물체의 유도는 재래귤 품종들과는 달리 식물생장 호르몬으 로써 GA3 와 탄수화물원으로써 sorbitol 과 galactose를 사용한 sorbitol 1.0M, galactose 1.0M, GA3 1.0mg·L-1 그리고 gelrite 3g·L-1가 첨가된 MT기본배지에서 정상적인 유식물체를 얻었다(Fig. 4). 선행연구에서(Jin et al., 2007) 온주밀감(궁천조생) 성 숙과실 내 미숙종자의 캘러스 세포로부터 유도된 체세포배는 정상적인 식물체를 직접적으로 유도하는데 쉽지가 않았다. 따라 서, 이들 체세포배는 GA3가 첨가된 배지 상에서 비 정상적인 식물체로 형성된 후 GA3가 첨가되지 않은 배지상에 옮겨 정상적 인 식물체로 유도하는 방법을 사용해야만 하였다. 그러나, 이 두 온주밀감 품종은 뿌리가 형성되지 않았다. 선행연구에 따르면 온주밀감 품종은 다른 감귤 품종들과는 달리 뿌리가 잘 형성되지 않는 유전자형을 갖고 있는 품종이기 때문에 탱자대목에 접 목시키는 방법을 통하여 증식시켰다고 하였다(Jin et al., 2007). 본 연구에서도 동일한 방법으로 정상적인 식물체를 증식시킬 수 있었다.
Fig. 4.
Induction of normal plants from Citrus unshiu Marc. somatic embryos: Induction of shoots from somatic embryos of C. unshiu Marc. (‘Miywagawa wase’) and in vitro micrografting with Poncirus trifoliate Raf. (A); induction of shoots from somatic embryos of C. unshiu Marc. (‘Haryejosaeng’) and in vivo grafting with Poncirus trifoliate Raf. (B). Vertical arrows indicate shoots
이들 제주도 재래감귤 3품종을 비롯한 온주밀감 2품종은 미숙 배주배양 세포로부터 유식물체를 유도하기 까지 걸린 기간은 약 9개월 소요되었다. 위 결과로부터 얻어진 유식물체들은 바이러스 감염여부 검증의 재료로 사용하였고, 이들 감귤 품종들에 대하여 확립된 조직배양 시스템은 우량 감귤품종 육성을 위한 재료 확보에 이용할 수 있으리라 기대된 다.
RT - PCR를 이용한 바이러스 감염여부 검증
노지 제주도 재래감귤 3품종과 온주밀감 2품종의 잎과 감귤 5품종의 미숙배주 배양을 통하여 얻어진 유식물체 5품종에 대 한 CTV 바이러스 감염여부는 CTV 유전자의 특정 서열부분을 디자인 한 프라이머 set(Table 1)들을 이용하여 RT - PCR로 검 증하였다.
CTV 유전자의 특정 서열부분을 디자인 한 CTV - 32 / 52 프라이머 set를 이용하여 RT - PCR한 결과 노지내의 감귤 5품종 중 제주도 재래감귤 청귤을 제외한 나머지 품종들은 모두 약 800bp의 positive control과 같은 위치에 공통적으로 증폭된 산물 이 확인되어 CTV에 감염되어 있음을 확인 할 수 있었다(Fig. 5A). 또한, CTV - Co - 1F / R 그리고 CTV - PoF / R set를 이용 하여 RT - PCR 검정을 수행한 결과 노지 감귤 5품종들은 모두 약 500bp의 positive control과 같은 위치에 공통적으로 증폭된 산물이 확인되어 CTV에 감염되어 있음을 확인 할 수 있었다(Fig. 5B, C). 비록 제주도 재래감귤 청귤 품종은 CTV - 32 / 52 프 라이머 set를 사용하여 RT - PCR로 검출되지 않았지만 다른 CTV 유전자의 특정 서열부분을 디자인 한 두 프라이머로는 검출 된 점으로 보아 제주도 재래감귤 청귤 또한 CTV에 감염되어 있음을 알 수 있었다. 반면 CTV에 감염된 감귤의 미숙배주 배양을 통하여 얻어진 유식물체 5품종들은 positive control과 같은 위치에 증폭된 산물이 확인되지 않아 이들 유식물체는 CTV에 감염되지 않은 무병주임을 알 수 있었다(Fig. 5). 바이러스는 유관속(vascular system)을 통하여 식물체 내부로 침입하는데, 배 주는 유관속으로 연결되어 있지 않기 때문에(Button and Kochba, 1977) 배주 배양을 통하여 얻어진 유식물체는 무병주였다는 연구결과와 동일 하였다(El - Sawy et al., 2005).
Fig. 5.
Detection of Citrus tristeza virus (CTV) from Citrus cultivars (Citrus spp.) obtained in vivo (ground leaves from the Citrus cultivars) and in vitro (leaves of seedlings obtained from nucellar embryogenic callus cells) using RT - PCR. Lane M, 100 bp marker; 1, ‘Miyagawa wase’; 2, ‘Cheongkyool’; 3, ‘Jikak’; 4, ‘Haryejosaeng’; 5, ‘Dongjeongkyool’; 6, ‘Miyagawa Wase.’; 7, ‘Cheongkyool’; 8, ‘Jikak’; 9, ‘Haryejosaeng’; 10, ‘Dongjeongkyool’; P, positive CTV control, Cultivars in lane 1 to 5 were produced in vivo, and those in lane 6 to 10 were producedin vitro.
항원 항체 반응을 이용한 CTV 감염 여부 검증
노지 감귤 5품종의 잎과 수정되지 않은 배주 배양을 통하여 얻어진 유식물체 5품종에 대한 CTV 감염 여부를 항원 항체 반 응을 통하여 검증하였다. 노지 감귤 5품종의 모든 잎들은 CTV 항원 항체 반응을 보였지만(Fig. 6A), 수정되지 않은 배주 배양 을 통하여 얻어진 5품종의 유식물체들은 모두 CTV 항원 항체 반응을 보이지 않았다(Fig. 6B).
Fig. 6.
Detection of Citrus tristeza virus (CTV) from Citrus cultivars (Citrus spp.) obtained in vivo and in vitro using the CTV immuneStrip test: ground leaves of Citrus cultivars (A); leaves of seedlings obtained from nucellar embryogenic callus cells (B). Horizontal arrows indicate the positive (+) control line for the dectection of Citrus tristeza virus.
이 결과로 비록 배양에 이용된 모본 감귤 식물체들이 CTV에 감염되었으나, 배주배양을 통하여 얻어진 유식물체들은 무병 주라는 것을 알 수 있었다(El - Sawy et al., 2005). 따라서, 수정되지 않은 배주 배양으로부터 얻어진 감귤 유식물체와 캘러스 세포는 생명공학기법을 적용하기 위한 재료로 이용 할 수 있고, 감귤품종의 무병주 식물체 획득을 위한 유용한 방법으로 활용 될 수 있을 것으로 기대된다.
